5—氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻生理生化特性的影響

李威+惲燁+張銀龍

摘要：在前期獲得5氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻種子萌發(fā)的急性毒性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，研究5-氟尿嘧啶（2.5～100 mg/kg）對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中葉綠素、可溶性蛋白和主要抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，短時(shí)間暴露時(shí)（7 d），5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中葉綠素和可溶性蛋白含量表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性也受到不同程度的誘導(dǎo)，對(duì)5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出一定的抗性；長(zhǎng)時(shí)間暴露時(shí)（21 d），3種作物幼苗葉片中葉綠素和可溶性蛋白含量下降，與5-氟尿嘧啶濃度表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，SOD、POD和CAT活性也不同程度地受到了抑制，抗氧化防御功能降低。本研究結(jié)果可為環(huán)境中5-氟尿嘧啶的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：5-氟尿嘧啶；生理生化；葉綠素；可溶性蛋白；抗氧化酶

中圖分類號(hào)： X820.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0465-04

隨著現(xiàn)代環(huán)境分析技術(shù)水平的提高，藥品類污染物在環(huán)境中的頻繁檢出引起了科學(xué)工作者對(duì)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的廣泛關(guān)注[1-2]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）是一種常用的抗癌藥，主要用于乳腺癌和消化系統(tǒng)癌等癌癥的治療。5-氟尿嘧啶經(jīng)注射或口服進(jìn)入人體后，60%～90%可被人體代謝排出，剩余10%～40%則以母體化合物的形式進(jìn)入醫(yī)院廢水或市政廢水中[3]。根據(jù)資料預(yù)測(cè)，污水處理廠出水中5-氟尿嘧啶的濃度可達(dá)到23 mg/L[4]。而且，隨著門診病人的增多，水環(huán)境中的抗癌藥濃度有升高的趨勢(shì)[5]，因此5-氟尿嘧啶的生態(tài)毒性效應(yīng)逐漸受到重視。

已有不少學(xué)者研究了5-氟尿嘧啶對(duì)不同的生物的生態(tài)毒性效應(yīng)。如Zounkova等研究發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶對(duì)惡臭假單胞菌生長(zhǎng)（Pseudomonas putida）的EC50值為0.027 mg/L，對(duì)近頭狀偽蹄形藻（Pseudokirchneriella subcapitata）的EC50值為0.11 mg/L，對(duì)綠藻（Desmodesmus subspicatus）的EC50值為48 mg/L，對(duì)大型蚤的EC50值為36 mg/L[6-7]。Deyoung等發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶對(duì)黑頭呆魚（Pimephales promelas）生長(zhǎng)的EC50值為400 mg/L[8]。惲燁等研究發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶對(duì)小麥（Triticum aestivum）、白菜（Brassica pekinensis）和水稻（Oryza sativa）種子的根伸長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度分別為212.80、102.53、13.30 mg/L[9]。

現(xiàn)有的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)表明，5-氟尿嘧啶不太可能引起急性毒性效應(yīng)，但是生物長(zhǎng)期暴露于低濃度的抗癌藥脅迫中，是否會(huì)引起生理生化等方面的影響還未可知。因此，本試驗(yàn)以小麥、白菜和水稻為受試生物，通過研究低濃度5-氟尿嘧啶長(zhǎng)期脅迫對(duì)小麥、白菜、水稻的葉綠素和抗氧化酶系統(tǒng)的影響，為5-氟尿嘧啶的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藥品5-氟尿嘧啶純度為99%，購(gòu)于北京百靈威科技有限公司。

供試種子為小麥（Triticum aestivum），偃展4110；白菜（Brassica pekinensis），青雜改良三號(hào)；水稻（Oryza. sativa），抗優(yōu)818。供試種子均購(gòu)自南京金盛達(dá)種子公司。

供試土壤采自南京林業(yè)大學(xué)北大山0～20 cm表土（修休耕地，未受人為污染，屬于清潔土壤），pH值為7.23，有機(jī)質(zhì)含量為2.86%，總氮、總磷、總鉀的含量分別為1.36、0.02、3.20 mg/kg。

1.2 幼苗生理生態(tài)毒性試驗(yàn)

稱取200 g風(fēng)干土壤于95 mm×60 mm×70 mm（上口直徑×下底直徑×高）的塑料花盆中（盆底鋪1層濾紙），采用土壤染毒法將配制好的5-氟尿嘧啶溶液按水土比1 ∶5投加到土壤中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，（25±1） ℃下暗平衡48 h。選取飽滿、均勻的小麥、白菜和水稻種子，滅菌消毒后用鑷子播種于土壤中，每盆15粒種子，調(diào)節(jié)水土比1 ∶5，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h，恒溫（25±1） ℃，早晚各澆水1次。5-氟尿嘧啶試驗(yàn)濃度為2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/kg，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每個(gè)處理3組平行，在培養(yǎng)的7、14、21 d分別采樣進(jìn)行分析測(cè)定。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定方法

葉綠素（Chlorophyll，Chl）的測(cè)定采用95%乙醇浸提法[10]。稱取0.05 g作物幼苗葉片剪碎至刻度試管中，加入10 mL 95%乙醇，使葉片完全浸入，加蓋放在暗處浸提至葉片完全變白時(shí)用分光光度計(jì)分別在665、649 nm測(cè)定浸提液的吸光度，根據(jù)公式（1）和（2）分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度（mg/g）。

稱取0.1 g作物幼苗的葉片在預(yù)冷的磷酸緩沖溶液（50 mmol/L NaH2PO4·Na2HPO4，pH值7.8，加1%聚乙烯吡咯烷酮）中勻漿，4 ℃下13 000 r/min離心30 min，上清液即為提取液[11]。可溶性蛋白（SP）含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[12]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)還原反應(yīng)法[10]；過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[10]；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 16.0 和Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重比較，統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中葉綠素含量的影響

不同濃度5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻的葉綠素含量的影響見圖1。暴露7 d時(shí)，3種作物葉片中葉綠素含量下降不明顯，與對(duì)照組百分比均大于90%，且在個(gè)別低濃度出現(xiàn)了一定的促進(jìn)作用，如5-氟尿嘧啶濃度為10 mg/kg時(shí)，小麥和白菜葉綠素含量分別高出對(duì)照組3.5%、7.8%。小麥和白菜各5-氟尿嘧啶處理組間在7 d時(shí)無顯著性差異，但水稻組間有顯著性差異（P<0.05）。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥、白菜和水稻葉片中葉綠素含量隨5-氟尿嘧啶濃度的升高而顯著下降。暴露14 d時(shí)，高濃度處理組與低濃度處理組間有顯著性差異，當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg和100 mg/kg時(shí)，小麥葉片葉綠素含量抑制率分別為0.3%和21.9%，白菜葉片葉綠素含量抑制率分別為4.7%和16.7%，水稻葉片葉綠素含量的抑制率分別為6.7%和17.5%。暴露21 d后，5-氟尿嘧啶對(duì)葉綠素的抑制效應(yīng)更加顯著，小麥、白菜和水稻在100 mg/kg 處理下分別低于對(duì)照組25.0%、30.5%、32.0%，各處理組間均有顯著差異，5-氟尿嘧啶對(duì)作物葉片葉綠素含量表現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中可溶性蛋白含量的影響

5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻葉片可溶性蛋白含量的影響見圖2。暴露7 d時(shí)，不同濃度的5-氟尿嘧啶對(duì)小麥和白菜可溶性蛋白含量沒有明顯影響，各處理組間均無顯著性差異；低濃度的5-氟尿嘧啶促進(jìn)了水稻可溶性蛋白含量增加，高濃度的5-氟尿嘧啶則明顯抑制了可溶性蛋白含量增加，低濃度處理組與高濃度處理組有顯著性差異，5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg 和100 mg/kg時(shí)，水稻葉片中可溶性蛋白的含量分別為對(duì)照組的103.2%和91.1%。暴露時(shí)間延長(zhǎng)到14 d時(shí)，5-氟尿嘧啶各處理組都促進(jìn)了小麥葉片中可溶性蛋白的含量，而對(duì)白菜葉片中的可溶性蛋白則表現(xiàn)為抑制作用，組間存在顯著性差異（P<0.05）。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)至21 d時(shí)，5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中的可溶性蛋白合成均有抑制作用，處理組間有顯著性差異（P<0.05）；當(dāng)5-氟尿嘧啶處理濃度為100 mg/kg時(shí)，對(duì)小麥、白菜和水稻可溶性蛋白含量的抑制率分別為20.9%、20.8%、26.8%。

2.3 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗抗氧化酶活性的影響

5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻3種作物幼苗葉片中SOD活性的影響如圖3所示。在暴露時(shí)間7、14 d時(shí)，小麥葉片中SOD的含量隨5-氟尿嘧啶濃度增加而有升高的趨勢(shì)；暴露21 d時(shí)，小麥葉片中SOD的含量則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，處理組間存在顯著性差異（P<0.05）。對(duì)于同一暴露濃度而言，小麥葉片中SOD含量隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，如在5-氟尿嘧啶濃度為50 mg/kg時(shí)，暴露7、14、21 d后，小麥葉片中SOD活性與對(duì)照組的百分比分別為117.2%、98.6%、77.5%。白菜和水稻葉片中SOD活性表現(xiàn)出了與小麥不同的變化規(guī)律。暴露7 d時(shí)，低濃度的5-氟尿嘧啶促進(jìn)了白菜和水稻葉片中的SOD活性，而高濃度的5-氟尿嘧啶則抑制了其活性，各處理組間具有顯著性差異（P<0.05）。暴露14、21 d 后，白菜和水稻葉片的SOD活性抑制率總體表現(xiàn)為隨5-氟尿嘧啶濃度增加而增加，如10、100 mg/kg 的5-氟尿嘧啶暴露21 d后，白菜葉片中SOD活性抑制率分別為24.4%、33.6%；水稻葉片中SOD活性抑制率分別為11.6%、34.9%。

5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中POD活性的影響見圖4。在不同暴露時(shí)間下，小麥葉片的POD活性均隨著5-氟尿嘧啶濃度的升高先上升后下降，變化接近于“鐘形”，且組間有顯著性差異（P<0.05）。白菜葉片中POD活性則隨著5-氟尿嘧啶的濃度升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且組間具有顯著性差異（P<0.05），當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度從2.5 mg/kg 增加到100 mg/kg，白菜葉片中POD活性抑制率在暴露14 d時(shí)從5.7%增加到17.3%，暴露21 d時(shí)由29.5%增加到34.5%。水稻暴露7 d時(shí)，POD的活性變化與小麥類似，即隨5-氟尿嘧啶濃度的升高先上升后下降，后隨時(shí)間延長(zhǎng)，其POD活性與5-氟尿嘧啶濃度表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，組間存在顯著性差異（P<0.05）。

5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中CAT活性的影響如圖5所示。小麥暴露7、14 d時(shí)，除100 mg/kg 5-氟尿嘧啶處理組外，CAT活性與對(duì)照組相近，受5-氟尿嘧啶影響不大。但暴露21 d時(shí)，小麥葉片中CAT活性則與5-氟尿嘧啶濃度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其抑制率由5-氟尿嘧啶處理濃度為2.5 mg/kg的1.5%增加至100 mg/kg時(shí)的32.4%，增加了30.9百分點(diǎn)。白菜暴露7 d時(shí)，5-氟尿嘧啶對(duì)其葉片中CAT活性無顯著影響。當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)到14、21 d時(shí)，白菜葉片中CAT活性的抑制率隨5-氟尿嘧啶濃度升高逐漸減低，且組間存在顯著性差異（P<0.05）。水稻葉片中CAT活性隨5-氟尿嘧啶濃度升高和暴露時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)，當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg時(shí)，暴露7、14、21 d后，水稻葉片中CAT活性的抑制率分別為8.7%、10.4%、24.5%；當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為100 mg/kg時(shí)，水稻葉片中CAT活性的抑制率分別為25.9%、29.0%、38.7%。

3 討論與結(jié)論

葉綠素含量是反映光合強(qiáng)度的重要指標(biāo)，可以作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[14]。在本研究中，低濃度的5-氟尿嘧啶（<10 mg/kg）短時(shí)間暴露時(shí)對(duì)3種作物葉片的葉綠素含量有一定的激活作用，但高濃度的5-氟尿嘧啶和較長(zhǎng)的暴露時(shí)間都使得作物葉片中的葉綠素含量降低，說明5-氟尿嘧啶影響了小麥、白菜和水稻的光合作用過程。這可能是因?yàn)樵谖廴疚锏拿{迫下，捕光葉綠素a/葉綠素b結(jié)合蛋白（Chl a/b-Pro）合成的轉(zhuǎn)錄過程受到抑制，而且初期形成的葉綠素單體也被光氧化分解，導(dǎo)致光捕獲化合物的形成受到影響，從而影響葉綠素的積累[15-16]。

可溶性蛋白含量是植物體內(nèi)代謝過程中蛋白質(zhì)損傷的重要指標(biāo)，其變化可以反映細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、變性及降解等多方面的信息[17]。當(dāng)植物適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)入旺盛的生長(zhǎng)期后，各種代謝活動(dòng)旺盛，可溶性蛋白的合成能力也有所增強(qiáng)。但是在有機(jī)物、重金屬以及寒旱等脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量可能會(huì)下降[13，18]。本研究中，短時(shí)間低濃度的5-氟尿嘧啶暴露可以誘導(dǎo)小麥、白菜和水稻幼苗中可溶性蛋白的合成，但是高濃度的5-氟尿嘧啶暴露則抑制了3種作物葉片中可溶性蛋白的合成，特別是高濃度5-氟尿嘧啶（≥20 mg/kg）處理21 d時(shí)，3種作物幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著下降。

有機(jī)物、重金屬污染以及干旱等不利環(huán)境條件或?qū)е轮参矬w內(nèi)H2O2和O-2· 等活性氧物質(zhì)的增多，植物的抗氧化防御體系則能去除或降低活性氧物質(zhì)的含量[19]。SOD、POD和CAT是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中典型的抗氧化酶，它們的活性變化間接指示了機(jī)體內(nèi)的氧化脅迫強(qiáng)度。SOD能將O-2· 轉(zhuǎn)化成O2和H2O2，抑制高活性·OH等自由基的形成，防止活性氧物質(zhì)積累對(duì)植物體的危害。在本研究中，低濃度的5-氟尿嘧啶短時(shí)間暴露時(shí)，小麥、白菜和水稻葉片中SOD活性有升高現(xiàn)象，可能是由于植物體內(nèi)活性氧物質(zhì)積累，激活本身存在的SOD酶或者通過誘導(dǎo)酶蛋白編碼基因的表達(dá)而激活機(jī)體本身合成新的 SOD[20]。POD和CAT是消除H2O2的重要酶類，它們可以協(xié)同作用將SOD歧化自由基的產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[17]。在暴露時(shí)間較短時(shí)，作物葉片中的POD和CAT的活性也受到一定程度的誘導(dǎo)，這與SOD誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2的量下降存在一定關(guān)系?？寡趸富钚缘膯?dòng)說明3種作物都具有一定的抵抗氧化脅迫的能力。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，小麥、白菜和水稻葉片中SOD、POD和CAT活性主要呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明5-氟尿嘧啶脅迫超過了植物細(xì)胞的耐受限度，抗氧化酶活性受到抑制，自身的抗氧化防御功能降低。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fent K，Weston A A，Caminada D. Ecotoxicology of human pharmaceuticals [J]. Aquatic Toxicology，2006，76（2）：122-159.

[2]Santos L H M L M，Araújo A N，F(xiàn)achini A，et al. Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment [J]. Journal of Hazardous Materrials，2010，175（1/2/3）：45-95.

[3]Straub J O. Combined environmental risk assessment for 5-fluorouracil and capecitabine in Europe[J]. Integrated EnvironmentalAssessment and Management，2009，6（S1）：540-566.

[4]Johnson A C，Jurgens M D，Williams R J，et al. Do cytotoxic chemotherapy drugs discharged into rivers pose a risk to the environment and human health？ An overview and UK case study [J]. Journal ofHydrology，2008，348（1/2）：167-175

[5]Besse J P，Latour J F，Garric J. Anticancer drugs in surface waters what can we say about the occurrence and environmental significance of cytotoxic，cytostatic and endocrine therapy drugs？ [J].Environmental International，2012，39（1）：73-86.

[6]Zounkova R，Odraska P，Dolezalova L，et al. Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cytostatic pharmaceuticals [J]. Environmental Toxicology and Chemistry，2007，26（10）：2208-2214.

[7]Zounkova R，Kovalova L，Blaha L，et al. Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cytotoxic antineoplastic drugs and their metabolites[J]. Chemosphere，2010，81（2）：253-260.

[8]Deyoung D J，Bantle J A，Hull M A，et al. Differences in sensitivity to developmental toxicants as seen in Xenopus and Pimephales embryos[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，1996，56（1）：143-150.

[9]惲 燁，李 威，張銀龍，等. 5-氟尿嘧啶與鎘單一及復(fù)合污染對(duì)三種作物種子萌發(fā)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（6）：1075-1081.

[10]劉家堯，劉 新. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京：高等教育出版社，2010：13-15.

[11]Polle A，Eiblemeier M，Sheppard L，et al. Responses of antioxidative enzymes to evelated CO2 in leaves of beech （Fagus sylvatica L.） seedlings grown under a range of nutrient regimes [J]. Plant Cell Environment，1997，20：1317-1321.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[13]Wu X Y，Von Tiedemann A. Impact of fungicides on active oxygen species and antioxidant enzymes in spring barley （Hordeum vulgare L.） exposed to ozone [J]. Environment Pollution，2002，116：37-47.

[14]劉碧云，周培疆，李佳潔，等. 丙體六六六對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)及光合色素和膜脂過氧化影響的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（1）：204-207

[15]Horvth G，Droppa M，Oravecz. Formation of the photosynthetic apparatus during greening of cadmium poisoned barley leaves [J]. Planta，1996，199：238-243.

[16]Alberte R S，F(xiàn)riedman A L，Gustafson D L，et al. Light-harvesting systems of brown algae and diatoms. isolation and characterization of chlorophyll a/c and chlorophyll a fucoxanthin pigment-protein complexes [J]. Biochimica et Biophysica Acta，1981，635（2）：304-316.

[17]肖明月，安 婧，紀(jì)占華，等. 六種常見抗生素對(duì)小白菜種子萌發(fā)及生理特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（10）：2775-2781.

[18]Liao X R，Chen J，Zhou Y F. Effect of salicylic acid on the isozymes of peroxidase and catalase in cells of wheat callus [J]. Journal of Triticeae Crops，2000，20（2）：66-68.

[19]安 婧，周啟星，劉維濤. 土霉素對(duì)小麥種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的生態(tài)毒性[J]. 環(huán)境科學(xué)，2009，30（10）：3022-3027.

[20]林仁漳，杜文超，王曉蓉，等. 土壤外源Cd對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)自由基代謝及抗氧化酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（1）：23-29.