鄭州市奶牛隱性乳腺炎病原菌的分離與鑒定

王軍+彭永帥+霍軍+石冬梅+皇甫和平

摘要：為了掌握鄭州市奶牛隱性乳腺炎發(fā)病情況，為奶牛隱性乳腺炎病的預(yù)防提供參考依據(jù)，結(jié)合LMT檢測(cè)方法進(jìn)行隱性乳腺炎細(xì)菌學(xué)分析，對(duì)鄭州市泌乳期960頭奶牛進(jìn)行細(xì)菌的分離和鑒定。結(jié)果表明，感染的細(xì)菌主要有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌，大腸桿菌、乳房鏈球菌、革蘭氏陽(yáng)性桿菌和酵母菌等27個(gè)菌株，其中3個(gè)乳區(qū)為混合感染。結(jié)果顯示，鄭州市奶牛隱性乳腺炎感染普遍存在，葡萄球菌和大腸桿菌是奶牛隱性乳腺炎的主要致病菌。

關(guān)鍵詞：奶牛；隱性乳腺炎；病原菌；分離；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.237.2+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0254-03

奶牛養(yǎng)殖業(yè)是綠色、高效、節(jié)糧型養(yǎng)殖業(yè)，世界各國(guó)都高度重視奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，把發(fā)展乳業(yè)作為提高國(guó)民營(yíng)養(yǎng)水平、增強(qiáng)國(guó)人體質(zhì)的大事來(lái)抓[1]。我國(guó)乳業(yè)隨著貯運(yùn)加工技術(shù)的提高和市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的帶動(dòng)，最近幾年發(fā)展較快。國(guó)家有關(guān)部門(mén)為了提高國(guó)民身體素質(zhì)，尤其是針對(duì)青少年和老年人的健康狀況，提出改變飲食習(xí)慣的“一杯奶”工程，宣傳鼓勵(lì)對(duì)乳及乳制品消費(fèi)，對(duì)乳業(yè)發(fā)展起到了推動(dòng)作用[2-3]。雖然我國(guó)人均乳及乳制品消費(fèi)與世界平均水平仍有較大差距，但在科技進(jìn)步帶動(dòng)下，人們的認(rèn)識(shí)不斷提高，不斷改變生活飲食習(xí)慣，使市場(chǎng)對(duì)乳及乳制品需求日益增長(zhǎng)，形成巨大的市場(chǎng)潛力。在良好的市場(chǎng)環(huán)境中，我國(guó)乳業(yè)發(fā)展正快速進(jìn)入品種優(yōu)良化、集約化、規(guī)?；纳a(chǎn)進(jìn)程，使奶牛產(chǎn)量和乳品總產(chǎn)量大幅提高。然而在努力加快乳業(yè)發(fā)展步伐和集約化、規(guī)?；曫B(yǎng)、追求高產(chǎn)時(shí)，疾病防治措施的相對(duì)滯后已成為主要問(wèn)題。各種疾病相應(yīng)增多，隱性乳腺炎在牛群中的流行更為普遍，由于隱性乳腺炎不出現(xiàn)乳房發(fā)熱、腫脹和疼痛等臨床癥狀，易被飼養(yǎng)者忽視，成為產(chǎn)奶量降低的主要因素[4-5]。而了解和掌握該病的發(fā)生、流行現(xiàn)狀和致病因素是有效的防治隱性乳腺炎的主要措施，也是乳業(yè)健康發(fā)展的保障[6]。因此，為了掌握鄭州市奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病情況，2014年5月至2015年4月，抽取鄭州市區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)泌乳期陽(yáng)性奶牛奶樣100份進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析，為奶牛乳隱性腺炎病的防控提供理論依據(jù)，引導(dǎo)人們科學(xué)健康地養(yǎng)殖奶牛。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)牛

2014年5月至2015年4月，對(duì)鄭州市10個(gè)奶牛場(chǎng)隨機(jī)取樣共960頭泌乳期奶牛奶樣3 833份，用于奶牛隱性乳腺炎細(xì)菌分離和鑒定。

1.2 試驗(yàn)器材

奶牛隱性乳腺炎診斷液（LMT），由中國(guó)農(nóng)科院蘭州中獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，性能類(lèi)似美國(guó)加州奶牛隱性乳腺炎診斷試劑（CMT）；無(wú)菌操作臺(tái)1架；奧林巴斯CKX41-A32RC型顯微鏡；載玻片、蓋玻片、血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、無(wú)菌試管若干、酒精燈、接種環(huán)、壓力鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電冰箱、藥敏片和染色液等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)核對(duì)后用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)， P<0.05時(shí)差異顯著，P<0.01差異極顯著。

1.4 方法

1.4.1 病原菌分離方法

1.4.1.1 奶樣采集 奶樣采集與LMT檢測(cè)結(jié)合進(jìn)行，奶牛乳房和乳頭清洗消毒后，經(jīng)LMT檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性乳區(qū)時(shí)，取滅菌10 mL試管采取該乳區(qū)奶樣5～8 mL，采乳樣時(shí)試管盡量不接觸乳頭，采后立即蓋上管塞，對(duì)采樣試管進(jìn)行標(biāo)號(hào)，于當(dāng)日送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)。

1.4.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 細(xì)菌培養(yǎng)前，將采集好的奶樣混合均勻，按照無(wú)菌操作的方法將奶樣分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱進(jìn)行增殖培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)物生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行記錄。對(duì)菌落進(jìn)行涂片、火焰固定、革蘭氏染色后鏡檢，根據(jù)培養(yǎng)物鏡檢結(jié)果，選擇特征性菌落接種血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，置恒溫箱72 h 重新培養(yǎng)，供細(xì)菌鑒定使用[7]。

1.4.1.3 細(xì)菌涂片、革蘭氏染色和鏡檢 火焰灼燒接種環(huán)，取少量蒸餾水于載玻片，然后取少量菌落在水中混合后涂勻，干燥后進(jìn)行火焰固定，抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液1 min水洗，加革蘭氏碘液媒染1 min水洗，加95%乙醇10～30 s水洗脫色，再滴加石碳酸復(fù)紅復(fù)染30 s水洗，自然干燥鏡檢。

1.4.2 細(xì)菌鑒定方法

1.4.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性鑒定 將細(xì)菌接種培養(yǎng)基培養(yǎng)后，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)以及菌落的形態(tài)、大小、特征、顏色等。鏈球菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良或不生長(zhǎng)，在血瓊脂上生長(zhǎng)為細(xì)小光滑、扁平或突起、邊緣整齊的白色菌落，并進(jìn)行記錄。肉湯接種培養(yǎng)后，觀察肉湯透明度、渾濁程度、管底是否有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附著物，是否出現(xiàn)菌臘膜、菌環(huán)等。在肉湯中除乳房鏈球菌使肉湯一致混濁外，無(wú)乳、停乳鏈球菌在管底形成絮狀沉淀。腸桿菌在肉湯中呈均勻混濁，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌環(huán)，然后進(jìn)行記錄。血瓊脂培養(yǎng)后，除觀察菌落生長(zhǎng)情況外，重點(diǎn)觀察其是否溶血及溶血特性[8]。α型溶血，在菌落周?chē)纬刹煌该鞯牟菥G色溶血環(huán)，停乳鏈球菌為α溶血；β型溶血，在菌落周?chē)纬赏耆该魅苎h(huán)；γ型溶血，乳房鏈球菌為γ型溶血，菌落周?chē)鸁o(wú)溶血現(xiàn)象。

1.4.2.2 細(xì)菌染色鏡檢和生化鑒定 細(xì)菌涂片后，使用革蘭氏染色法染色，將染色后的涂片鏡檢，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色，用以區(qū)分細(xì)菌類(lèi)別。染色后進(jìn)行病原體鏡檢，主要觀察細(xì)菌形態(tài)特征，根據(jù)病原菌大小、形態(tài)、有無(wú)莢膜、芽孢等特征進(jìn)行細(xì)菌鑒定[9]。對(duì)經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)檢查初步鑒定的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛隱性乳腺炎LMT檢測(cè)結(jié)果

在做細(xì)菌分離鑒定的同時(shí)，采用LMT檢測(cè)方法的進(jìn)行奶牛隱性乳腺炎的調(diào)查，在不同規(guī)模的10個(gè)奶牛場(chǎng)檢測(cè)奶牛960頭，檢出LMT陽(yáng)性奶牛490頭，平均陽(yáng)性率為51.04%。其中，陽(yáng)性率最低的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，陽(yáng)性率為30.30%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場(chǎng)陽(yáng)性率最高，達(dá)到66.67%，普通養(yǎng)殖場(chǎng)的陽(yáng)性率為56.67%。檢測(cè)結(jié)果表明，鄭州市奶牛場(chǎng)乳腺炎感染較為普遍，不同奶牛場(chǎng)乳腺炎陽(yáng)性率差異極顯著（P<0.01），尤其以養(yǎng)殖小區(qū)最為嚴(yán)重。

2.2 隱性乳腺炎陽(yáng)性乳區(qū)細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果

隱性乳腺炎陽(yáng)性乳區(qū)細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1所示，根據(jù)LMT檢測(cè)基礎(chǔ)上，共采集陽(yáng)性乳區(qū)奶樣100份，共有84份乳樣檢出細(xì)菌，檢出率84.00%，其中養(yǎng)殖小區(qū)檢出率最高，可達(dá)94.44%，普通養(yǎng)殖場(chǎng)檢出率為80.00%，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)檢出率最低為75.00%。

2.3 細(xì)菌鑒定結(jié)果

由表2可知，對(duì)100份乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共檢出細(xì)菌27株，其中有3株為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性桿菌混合感染，混合感染率為11.11%。檢出菌中，金黃色葡萄球菌9株，占33.33%；表皮葡萄球菌3株，占細(xì)菌總數(shù)的11.11%，凝固酶陰性葡萄球菌2株，占細(xì)菌總數(shù)的7.41%；無(wú)乳、停乳和乳房鏈球菌各檢出3、2、1株，分別占檢出細(xì)菌總數(shù)的11.11%、7.41%、3.70%；革蘭氏陽(yáng)性桿菌共檢出2株，占7.41%；檢出酵母菌1株，占總檢出率的3.70%；金黃色葡萄球菌和大腸桿菌占54%，為奶牛隱性乳腺炎的主要致病菌。

2.4 不同奶牛場(chǎng)隱性乳腺炎感染細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群

在10個(gè)不同的牛場(chǎng)乳樣中，養(yǎng)殖小區(qū)場(chǎng)檢出菌19株，金黃色葡萄球菌7株、表皮葡萄球菌2株、凝固酶陰性葡萄球菌1株、鏈球菌4株、大腸桿菌3株、革蘭氏陽(yáng)性桿菌和酵母菌各1株，細(xì)菌種類(lèi)較雜，其優(yōu)勢(shì)菌群為葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌。普通養(yǎng)殖場(chǎng)檢出菌共13株，其中金黃色葡萄球菌3株、凝固酶陰性葡萄球菌2株、無(wú)乳鏈球菌1株、停乳鏈球菌2株、大腸桿菌3株、革蘭氏陽(yáng)性桿菌1株，其優(yōu)勢(shì)菌群為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌停乳鏈球菌和大腸桿菌。規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)共檢出菌7株，金黃色葡萄球菌3株，表皮葡萄球菌2株，無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌各1株，可見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌為金黃色葡萄球菌（表3）。

3 結(jié)論與討論

奶牛乳腺炎的致病因素中，病原微生物感染是最重要的致病因素，本試驗(yàn)在做細(xì)菌分離鑒定的同時(shí)，采用LMT方法進(jìn)行奶牛隱性乳腺炎的調(diào)查，在不同規(guī)模的10個(gè)奶牛場(chǎng)檢測(cè)奶牛960頭，檢出LMT陽(yáng)性奶牛490頭，平均陽(yáng)性率為51.04%。其中陽(yáng)性率最低的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，陽(yáng)性率為30.30%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場(chǎng)陽(yáng)性率最高，達(dá)到66.67%，說(shuō)明奶牛隱性乳腺炎的發(fā)生率與飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生條件差密切相關(guān)，飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生差的養(yǎng)殖小區(qū)要比規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)隱性乳腺炎感染率高。

本試驗(yàn)通過(guò)LMT檢測(cè)，在被確定為隱性乳腺炎患牛的陽(yáng)性乳區(qū)，采樣共100份，經(jīng)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)，共有84份乳樣檢出細(xì)菌，檢出率84%，其中養(yǎng)殖小區(qū)檢出率最高，為94.44%，普通養(yǎng)殖場(chǎng)檢出率為80.00%，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)檢出率最低為75%，高出國(guó)內(nèi)學(xué)者的報(bào)道60%和63.48%，說(shuō)明此次調(diào)查的養(yǎng)殖場(chǎng)，尤其是養(yǎng)殖小區(qū)應(yīng)采取措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理降低隱性乳腺炎的發(fā)生率。

引起隱性乳腺炎的生物性致病因素中，病原種類(lèi)多達(dá)150多種，奶牛隱性乳腺炎的檢測(cè)方式有很多[10]，也有人認(rèn)為，隱性乳腺炎診斷是以牛奶中體細(xì)胞含量為標(biāo)準(zhǔn)判定，本試驗(yàn)結(jié)果可能與所取病料相關(guān)，取病料時(shí)有的奶牛因機(jī)體防御系統(tǒng)清除了乳腺中的病原微生物，但組織損傷尚未修復(fù)，奶中體細(xì)胞含量仍維持在較高水平，這一類(lèi)隱性乳腺炎病例，奶樣中檢測(cè)不到細(xì)菌，也有可能有些細(xì)菌采用的分離培養(yǎng)方法要求比較高，無(wú)法獲得細(xì)菌，也不能排除有特殊病原體感染的可能性[9-11]，還有可能是物理化學(xué)因素影響引起隱性乳腺炎的發(fā)生，所以隱性乳腺炎細(xì)菌陽(yáng)性率低于LMT陽(yáng)性率，這還有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)為細(xì)菌學(xué)鑒定，因受各種因素的影響，只能采用綜合判定方法，本次試驗(yàn)采用獸南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平編寫(xiě)的獸醫(yī)微生物學(xué)和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）資料中的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)100份乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共檢出細(xì)菌27株，其中有3株為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性桿菌混合感染，混合感染率為11.11%。檢出菌中，金黃色葡萄球菌9株，占33.33%；表皮葡萄球菌3株，占細(xì)菌總數(shù)的11.11%，凝固酶陰性葡萄球菌2株，占細(xì)菌總數(shù)的7.41%；無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌各檢出3、2、1株，分別占檢出細(xì)菌總數(shù)的11.11%、7.41%、3.70%；革蘭氏陽(yáng)性桿菌共檢出2株，占7.41%；檢出酵母菌1株，占總檢出率的3.70%；金黃色葡萄球菌和大腸桿菌占54%，為奶牛隱性乳腺炎的主要致病菌，這為以后隱性乳腺炎的預(yù)防提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

奶牛隱性乳腺炎病原微生物的傳播方式可分為傳染性和環(huán)境性?xún)纱箢?lèi)，傳染性病原菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌，這類(lèi)菌主要經(jīng)擠奶過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)通過(guò)擠奶器、擠奶工的手、擦洗乳房過(guò)程所用的毛巾、水等傳播，給奶牛業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本次試驗(yàn)中分離出27株病原菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢出率為較高，結(jié)果表明鄭州市區(qū)奶牛隱性乳腺炎主要由傳染性病原菌感染傳播為主，所以在今后的隱性乳腺炎預(yù)防中要想降低奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率，必須在擠奶環(huán)節(jié)強(qiáng)化衛(wèi)生消毒措施，降低病原在奶牛間的相互傳播概率。

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