土壤高壓蒸汽滅菌的條件優(yōu)化及其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

曹鵬+付學(xué)鵬+王紹嫻+吳鳳芝

摘要：利用高壓蒸汽對(duì)土壤滅菌是研究土壤微生物學(xué)的常用方法，用高壓蒸汽滅菌方法（121 ℃，30 min）對(duì)土壤滅菌，調(diào)查滅菌次數(shù)對(duì)土壤滅菌效果、土壤化學(xué)性質(zhì)變化、黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，滅菌1次即可完全清除土壤里的真菌，但滅菌3次才可完全清除土壤里的細(xì)菌；滅菌土壤的pH值和EC值均顯著高于未滅菌土壤，且隨著滅菌次數(shù)的增加，pH值和EC值都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；土壤滅菌顯著降低黃瓜幼苗的株高和地上部鮮質(zhì)量，并且隨著滅菌次數(shù)的增加，黃瓜幼苗的株高和地上部鮮質(zhì)量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；與滅菌2次的土壤相比，滅菌3次的土壤對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制作用不顯著，并且pH值和EC值的變化也不顯著。因此，在土壤微生物學(xué)研究中需要根據(jù)需要選擇滅菌次數(shù)。

關(guān)鍵詞：高壓蒸汽滅菌；滅菌次數(shù)；土壤微生物；植物生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)： Q93-334；S642.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0456-03

土壤滅菌能夠消除或降低土壤微生物活性，是土壤生物學(xué)研究中常用的試驗(yàn)方法。在研究土壤-微生物-植物之間的相互作用、土壤單一菌群、土壤酶、土壤有機(jī)質(zhì)降解與吸附以及殺菌劑在土壤中的移動(dòng)等方面都要求土壤的無菌環(huán)境[1-4]。比如作物連作會(huì)降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴(yán)重的連作障礙。對(duì)土壤進(jìn)行滅菌能夠研究土壤微生物對(duì)作物連作障礙的“貢獻(xiàn)”。季尚寧等對(duì)連作大豆的土壤進(jìn)行滅菌處理后種植大豆，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過滅菌的大豆茬土壤栽培的株高、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均大大超過了未滅菌的豆茬土壤，緩解了連作障礙[5]；吳鳳芝等對(duì)連作黃瓜的土壤滅菌后，種植黃瓜幼苗的株高、莖粗和根系活力都顯著高于未滅菌土壤中的植株[6]。

目前常用的土壤滅菌方法有高溫滅菌法、γ射線滅菌法、化學(xué)熏蒸法、苯菌靈抑制法和物理割斷法等5種常用方法。這5種方法各有利弊：高溫滅菌法、γ射線滅菌法和化學(xué)熏蒸法適用于室內(nèi)試驗(yàn)，但它們對(duì)土壤理化性質(zhì)有一定的影響；化學(xué)熏蒸法會(huì)污染環(huán)境；苯菌靈抑制法和物理割斷法適用于室外試驗(yàn)，其中苯菌靈抑制法也會(huì)污染環(huán)境，須嚴(yán)格控制藥劑用量；物理割斷法雖然環(huán)保，但可能影響土壤中水分和營(yíng)養(yǎng)成分的交換[2-3，7-9]。

在眾多的土壤滅菌方法中，高壓蒸汽滅菌是實(shí)驗(yàn)室普遍使用的方法，國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)告中都采用高壓蒸汽滅菌方法進(jìn)行土壤滅菌[3，10-11]。高壓蒸汽滅菌的效果受到滅菌的溫度、滅菌時(shí)間、滅菌次數(shù)等條件的影響，并且高壓蒸汽滅菌能夠引起土壤理化性質(zhì)的改變，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)。Mahmood等用121℃高壓蒸汽對(duì)土壤滅菌1 h，顯著提高了土壤的電導(dǎo)率、水溶性碳和可溶性錳，提高了小麥根的生物量、根長(zhǎng)、表面積、體積及根尖數(shù)[3]。Verhagen等為研究根際細(xì)菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性，對(duì)土壤進(jìn)行蒸汽滅菌2次，每次20 min[8]。李會(huì)娜等對(duì)土壤進(jìn)行高壓滅菌3次（121 ℃、30 min，連續(xù)3 d），發(fā)現(xiàn)菜園土滅菌后，紫莖澤蘭的株高和生物量顯著低于對(duì)照處理（未滅菌），而對(duì)于番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[12]。梁智等用高壓蒸汽滅菌，在1 個(gè)大氣壓下高溫濕熱滅菌2 h，使棉花株高降低12.7%，地上部干物質(zhì)質(zhì)量減少66.7%，地下部干物質(zhì)質(zhì)量減少44.5%[13]。由此可見，對(duì)于土壤的高壓蒸汽滅菌的條件比較混亂，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，最重要的是沒有驗(yàn)證不同滅菌條件下的滅菌效果。目前對(duì)于高壓蒸汽滅菌的溫度、時(shí)間、次數(shù)、滅菌效果及其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，研究滅菌次數(shù)對(duì)土壤真菌、細(xì)菌的清除效果，以及對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響，以期對(duì)利用高壓蒸汽進(jìn)行土壤滅菌的條件進(jìn)行優(yōu)化，為相關(guān)研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 黃瓜品種為津研四號(hào)，購(gòu)自天津科潤(rùn)黃瓜研究所。

1.1.2 供試土壤 土壤為采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站的育苗土。

1.2 方法

1.2.1 土壤滅菌 試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：未滅菌（CK）、滅菌1次（CS1）、滅菌2次（CS2）、滅菌3次（CS3）。將2 kg土壤樣品裝入直徑為25 cm、長(zhǎng)度為40 cm的滅菌袋（高密度聚乙烯膜，北京鑫明宏塑料有限公司）中圖1，于立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）中滅菌，每次滅菌的條件為121 ℃（0. 1～0.2 MPa）高溫滅菌30 min。每次滅菌間隔24 h。

1.2.2 滅菌土壤中細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)和數(shù)量檢測(cè) 參照Komad等的方法[14-15]，用平板培養(yǎng)法測(cè)定黃瓜根際土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量。細(xì)菌測(cè)定采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌測(cè)定采用馬丁氏培養(yǎng)基。

[FK（W13][TPCP1.tif]

本試驗(yàn)中所用的滅菌袋每袋裝入2 kg土，是為了保證滅菌效果和高壓滅菌器的容積，使其更有利于滅菌。將每個(gè)處理的土壤隨機(jī)取出3袋，在超凈工作臺(tái)（DL-CJ-2ND，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）中取袋中間部分的土壤5 g，加入到盛有45 mL無菌水的錐形瓶（250 mL）中，振蕩15 min使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，靜置1 min后依次制成10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀釋液。

在超凈工作臺(tái)中，依次在分離細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)基上用平板涂布法涂布10-5、10-3、10-2的土壤稀釋液100 μL，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)涂布5個(gè)平板。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3～7 d，觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算單位質(zhì)量干土細(xì)菌和真菌的數(shù)量。

1.2.3 滅菌次數(shù)對(duì)土壤pH值和EC值的影響 根據(jù)鮑士旦等的方法[16]，分別取不滅菌（CK）、滅菌1次（CS1）、滅菌2次（CS2）、滅菌3次（CS3）土壤各5 g溶于25 mL無菌蒸餾水（土水比1 ∶5）中，充分混勻后分別用pH計(jì)（S20，梅特勒-托利多儀器有限公司）和電導(dǎo)率儀（FE30，梅特勒-托利多儀器有限公司）測(cè)定pH值和EC值。

1.2.4 土壤滅菌次數(shù)對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響 2014年11月30日播種育苗，子葉展平時(shí)定植于裝有上述不同處理土壤的營(yíng)養(yǎng)缽（8 cm×8 cm）中，每缽200 g土、1株黃瓜幼苗。每個(gè)處理30次重復(fù)，共120缽。于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站人工氣候室培養(yǎng)，光照時(shí)間和濕度設(shè)置：光照時(shí)間12 h/d（6：00—20：00），光照度為7 000 lx；濕度為75%。每2 d每缽定量澆50 mL無菌水。不使用殺菌劑和殺蟲劑。為了消除光照造成的誤差，定期調(diào)換幼苗的位置。

在定植20 d（2葉1心期）和40 d（4葉1心期）時(shí)取樣，每個(gè)處理分別隨機(jī)選10株黃瓜幼苗測(cè)定株高和地上部鮮質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌次數(shù)對(duì)土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量的影響

高壓蒸汽滅菌能有效殺死土壤中的微生物。由表1、圖2可見，與對(duì)照相比，滅菌1次（CS1）可以有效地殺滅土壤中的真菌，且培養(yǎng)3、4 d的平板都未見真菌菌落出現(xiàn)，說明滅菌1次即可殺滅土壤中的真菌；但是對(duì)于細(xì)菌，滅菌2次后還有大量的菌落出現(xiàn)，直到滅菌3次才未見菌落出現(xiàn)。

2.2 滅菌次數(shù)對(duì)土壤pH值和EC值的影響

由圖3可以看出，未滅菌的土壤pH值顯著低于滅菌土壤，但是滅菌不同次數(shù)的土壤其pH值變化不顯著；土壤EC值隨土壤滅菌次數(shù)的增加而升高，但是滅菌2、3次的EC值差異不顯著。

2.3 滅菌次數(shù)對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

黃瓜幼苗定植40 d的生長(zhǎng)情況見圖4。本研究中未滅菌土壤種植的黃瓜幼苗在20、40 d時(shí)地上部鮮質(zhì)量和株高均顯著高于滅菌土壤；與對(duì)照相比，隨著滅菌次數(shù)的增加，在20 d時(shí)，黃瓜幼苗的地上部鮮質(zhì)量分別減少了25%、49%和52%，株高分別降低了13%、27%和29%，但2次滅菌和3次滅菌差異不顯著；在40 d時(shí)，黃瓜地上部鮮質(zhì)量分別減少了25%，60%和63%，株高分別降低了24%、37%和40%，但2次滅菌和3次滅菌差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

高壓蒸汽滅菌是在較高的溫度和氣壓下進(jìn)行的，勢(shì)必會(huì)對(duì)土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)。Mahmood 等用121 ℃高壓蒸汽對(duì)土壤滅菌1 h，顯著提高了土壤的電導(dǎo)率[3]，和本試驗(yàn)結(jié)果一致。李會(huì)娜等用高壓蒸汽滅菌3次的菜園土培養(yǎng)紫莖澤蘭，發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的株高和生物量顯著低于對(duì)照處理（未滅菌）[12]。梁智等用高壓蒸汽滅菌的土壤種植棉花，使棉花株高降低12.7%，地上部干物質(zhì)質(zhì)量減少66.7%，地下部干物質(zhì)質(zhì)量減少44.5%[13]。

在本試驗(yàn)中，利用高壓蒸汽滅菌器，在121 ℃（0.1～0.2 MPa）條件下滅菌，每次滅菌30 min，滅菌1次就能消除土壤中的真菌，而消除細(xì)菌則需要滅菌3次。滅菌次數(shù)越多必然使滅菌效果更好，但是不可避免地會(huì)對(duì)土壤的理化性質(zhì)造成影響。與未滅菌的土壤相比，滅菌顯著提高了土壤的pH值和EC值，但是滅菌2次和滅菌3次后這2個(gè)指標(biāo)沒有顯著變化。同樣，從對(duì)植物生長(zhǎng)的反饋結(jié)果來看，幾次滅菌的土壤均顯著抑制了黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，但是滅菌2次和3次的土壤對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響則不顯著。因此，如果想消除土壤中的真菌，只要滅菌1次即可；而要消除所有的微生物，則最好滅菌3次。

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