不同方法提取草菇多糖體外抗氧化活性

凡軍民+李靜+賈君+謝春芹+謝正林

摘要：分別采用熱水提取法、酶法、微波法、堿法4種不同方法提取草菇多糖，并對其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明：不同方法提取的草菇多糖對·OH、DPPH·都較強(qiáng)的清除作用；纖維素酶法、微波法是較佳的2種提取抗氧化草菇多糖的方法，其多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化、還原能力。

關(guān)鍵詞：草菇；多糖；提取方法；抗氧化性

中圖分類號： S646.1+30.1；O629.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0323-03

草菇（Volvariella volvacea）菇肉脆嫩，味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，是食用菌中栽培方法最簡單、出菇最快、原料最豐富、最可口的食用菌之一。早在300年前，我國已經(jīng)進(jìn)行草菇的人工栽培，后由華僑傳到世界各國成為第3大栽培食用菌。我國草菇年產(chǎn)量高于3萬t，占全世界總產(chǎn)量的70%～80%，居世界之首，故國際上稱其為“中國蘑菇”[1]。

草菇中抗氧化活性成分已有一些報(bào)道[2-4]，主要有總酚類、多糖類、三萜類、黃酮類化合物等。Cheung等采用3種不同方法評價(jià)草菇的甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，水提取物的抗氧化活性高于甲醇提取物，其抗氧化活性與總酚含量有關(guān)[3]。趙俊霞等用不同有機(jī)溶劑對草菇培養(yǎng)液及菌絲體中的代謝成分進(jìn)行分離提取，代謝提取物均有較高的 DPPH·清除率，即較高的抗氧化活性，其有效成分含有粗三萜、黃酮類物質(zhì)[4]。

本研究通過熱水提取法、酶法、微波法、堿法4種不同提取方法對草菇多糖進(jìn)行提取，并測定其體外抗氧化活性，探討不同提取方法對草菇多糖清除自由基能力的影響，旨在尋找最佳的提取方法，為草菇的精深加工提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：草菇子實(shí)體，購于農(nóng)貿(mào)市場。

試劑：95%乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、維生素C、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、鄰苯三酚、無水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（trichloroacetic acid，簡稱TCA）、氯化鐵、甲醇、氯化亞鐵、乙二胺四乙酸（EDTA），均為國產(chǎn)分析純；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司），菲洛嗪（Ruibio進(jìn)口分裝）。

儀器：賽多利斯電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TDL-5A低速臺式大容量離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)（北京中教金源科技有限公司）；LGJ-12普通型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.2 草菇多糖提取工藝流程

草菇→預(yù)處理→不同方法提取→減壓濃縮→乙醇沉淀→透析→冷凍干燥→草菇多糖。

1.3 草菇多糖提取方法

1.3.1 草菇的預(yù)處理 新鮮草菇子實(shí)體洗凈、去雜、切塊，置于105 ℃烘箱滅活10 min；65 ℃烘干、粉碎，得到草菇碎屑；95%乙醇室溫過夜，浸提3次，過濾，殘?jiān)胖糜陉帥鎏庯L(fēng)干待用。

1.3.2 熱水提取法 取預(yù)處理的草菇干制品，按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水，沸水提取1 h，過濾。按照“1.3.1”節(jié)中的步驟共提取2次，合并提取液。

1.3.3 酶法提取法 取預(yù)處理的草菇干制品，按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水，纖維素酶、蝸牛酶加入量為0.35%（質(zhì)量體積比），50 ℃提取90 min，升溫至90 ℃滅活酶，過濾，得提取液。

1.3.4 微波提取法 取預(yù)處理的草菇干制品，按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水，乳化10 min，微波處理功率為490 W，提取8 min，過濾。按照“1.3.1”節(jié)中的步驟共提取2次，合并提取液。

1.3.5 堿法提取 取水提后草菇殘?jiān)凑樟弦罕? g ∶10 mL 加入0.5 mol/L NaOH溶液，于4 ℃提取2次，每次4 h，過濾，濾液中加入3 mol/L HCl，調(diào)pH值至7.0。

1.3.6 提取多糖的濃縮干燥 將提取液于60 ℃減壓濃縮至原體積的1/10，4 000 r/min離心10 min，去除沉淀；在濃縮液中緩緩加入95%乙醇，使?jié)饪s液與乙醇體積比為1 ∶4；靜置過夜，離心，沉淀物用蒸餾水溶解，溶解液透析（分子截留量為10 ku），冷凍干燥，分別得到水提多糖WPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、微波提多糖MPF75、堿提多糖APF75。

1.4 草菇多糖的含量測定

多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法，參照2005年版《中華人民共和國藥典》。

1.5 抗氧化活性的測定

1.5.1 · OH清除活性的測定[5]分別吸取1.0 mL各濃度樣液，依次加入3.0 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、3.0 mL1 mmol/L H2O2溶液，靜置10 min。再加入3 mL 6 moL/L水楊酸溶液，37 ℃水浴30 min，在510 nm處測定吸光度D510 nm，以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式：

清除率=[1-（Di（510 nm）-Dj（510 nm））/D0（510 nm）]×100%。

式中：Di（510 nm）為不同多糖濃度下的吸收度；Dj（510 nm）為用蒸餾水代替水楊酸時(shí)測得的不同多糖濃度本底吸光度；D0（510 nm）為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行測3次，求清除率的平均值。

1.5.2 清除活性測定[6]取4.5 mL50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH值=8.2），加入1.0 mL各濃度樣液，25 ℃水浴20 min，立即加入0.4 mL于25 ℃預(yù)熱過的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，25 ℃水浴5 min。加入1 mL 8 mmol/L HCl 終止反應(yīng)，在320 nm處測定吸光度D320 nm，以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式：

清除率=[1-Di（320 nm）/D0（320nm）]×100%。

式中：Di（320 nm）為不同多糖濃度下的吸光度；D0（320 nm）為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行做3次，求清除率的平均值。

1.5.3 DPPH·清除活性測定[5]分別吸取4.0 mL各濃度樣液與0.2 mmol/L DPPH溶液，加入具塞試管中搖勻，黑暗條件下于37 ℃放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液于517 nm處測吸光度D517 nm，以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式：

清除率=[1-（Di（517 nm）-Dj（517 nm））/D0（517 nm）]×100%。

式中：Di（517 nm）為不同多糖濃度下的吸光度；Dj（517 nm）為用無水乙醇代替DPPH溶液時(shí)測得的不同多糖濃度本底吸光度；D0（517 nm）為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行測3次，求清除率的平均值。

1.5.4 還原力測定[7]取2.5 mL各濃度樣液，各加入2.5 mL 0.2 moL/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）、1%K3Fe（CN）6 溶液，混勻后于50 ℃水浴20 min。加入2.5 mL 10% 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，3 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液，分別加入5.0 mL蒸餾水、1.0 mL 0.1% FeCl3，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度D700nm，每個(gè)濃度平行測3次，以維生素C作陽性對照。

1.5.5 對金屬離子螯合活性測定[7]取1.0mL各濃度樣液，分別加入3.7 mL甲醇、0.1 mL 2 mmol/L FeCl2、0.2 mL5 mmol/L 菲洛嗪，25 ℃反應(yīng)10 min后，于562 nm處測定吸光度D562 nm，每個(gè)濃度平行測3次，以EDTA作為對照。金屬離子螯合力計(jì)算公式：

螯合力=[1-Di（562 nm）/D0（562 nm）]×100%。

式中：Di（562 nm）為不同多糖濃度下的吸光度；D0（562 nm）為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。

1.5.6 半抑制質(zhì)量濃度IC50的計(jì)算 以多糖濃度為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)，繪制不同方法提取草菇多糖的清除率曲線。以縱坐標(biāo)的清除率50%作水平線，與清除率曲線相交點(diǎn)，即為半抑制質(zhì)量濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取草菇多糖及其含量測定

提取結(jié)果表明，水提多糖WPF75、微波提多糖MPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、堿提多糖APF75V得率分別為16.92%、15.56%、22.57%、21.38%、1.92%，可見蝸牛酶提多糖SAPF75得率最高，纖維素酶提多糖CAPF75次之，堿提多糖APF75最低。酶能最大限度地釋放胞內(nèi)外游離、部分結(jié)合的多糖成分，因此含量最高；由于水提法的時(shí)間長、次數(shù)多，含量也較高。

2.2 不同方法提取草菇多糖對·OH清除作用的比較

由圖1可知，草菇多糖具有較強(qiáng)的清除·OH作用，在質(zhì)量濃度0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高；在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，微波提多糖MPF75與纖維素酶提多糖CAPF75對·OH的清除率均大于陽性對照維生素C，且具有明顯的量效關(guān)系；微波提多糖MPF75、纖維素酶提多糖CAPF75半抑制質(zhì)量濃度IC50分別低于0.10、0.89 mg/mL，陽性對照維生素C的IC50為0.11 mg/mL；在質(zhì)量濃度1.0～5.0 mg/mL 范圍內(nèi)，微波提多糖MPF75與纖維素酶提多糖CAPF75對·OH的清除率與陽性對照維生素C相當(dāng)，對·OH 自由基的清除率為98.36%。

在質(zhì)量濃度0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，堿提多糖APF75、水提多糖WPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為0.60、2.00、2.75 mg/mL，且具有明顯的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度1.0～5.0 mg/mL范圍，草菇多糖對·OH的清除作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>堿提多糖APF75>水提多糖WPF75>蝸牛酶提多糖SAPF75。

結(jié)果表明，微波提多糖MPF75和纖維素酶提多糖CAPF75具有較強(qiáng)的清除·OH能力，其能力≥陽性對照維生素C。

2.3 不同方法提取草菇多糖對O-2· 清除活性的比較

由圖2可知，在不同方法提取草菇多糖對O-2· 的清除作用的比較中，只有纖維素酶提多糖CAPF75對O-2· 具有清除作用。蝸牛酶提多糖SAPF75、微波提多糖MPF75、堿提多糖APF75、水提多糖WPF75的清除活性均為0；在質(zhì)量濃度0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，纖維素酶提多糖CAPF75對O-2· 的清除活性逐漸增強(qiáng)，最大清除率為98.32%，且IC50為0.12 mg/mL。結(jié)果表明：僅纖維素酶提多糖CAPF75具有較強(qiáng)的清除O-2· 能力。

2.4 不同方法提取草菇多糖對DPPH·清除活性的比較

由圖3可知，草菇多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH·作用，在質(zhì)量濃度0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高，且具有明顯的量效關(guān)系；在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，草菇多糖清除DPPH·作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>纖維素酶提多糖CAPF75>水提多糖WPF75>微波提多糖MPF75；在質(zhì)量濃度1.0～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，草菇多糖對DPPH·的清除作用發(fā)生變化，其作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75>纖維素酶提多糖CAPF75>堿提多糖APF75>微波提多糖MPF75。蝸牛酶提多糖SAPF75、水提多糖WPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、微波提多糖MPF75的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為0.100、0.460、0.463、0.464 mg/mL。

結(jié)果表明，5種不同方法提取草菇多糖均有較強(qiáng)的清除DPPH·能力，且質(zhì)量濃度越大，其清除率越高。

2.5 不同方法提取草菇多糖還原活性的比較

由圖4可知，草菇多糖具有一定的還原力，在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL的范圍內(nèi)，5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高，且具有明顯的量效關(guān)系，還原活性由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>纖維素酶提多糖CAPF75>微波提多糖MPF75>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75。在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，堿提多糖APF75的還原活性也大于陽性對照維生素C。在質(zhì)量濃1.5～2.5mg/mL范圍內(nèi)，5種不同方法提取草菇多糖還原力由強(qiáng)至弱排序?yàn)槔w維素酶提多糖CAPF75>微波提多糖MPF75>陽性對照維生素C>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75。可見草菇多糖的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關(guān)性，還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。

結(jié)果表明，纖維素酶提多糖CAPF75和微波提多糖MPF75具有較強(qiáng)的還原能力，反映其抗氧化能力較強(qiáng)。

2.6 不同方法提取草菇多糖金屬子螯合力的比較

由圖5可知，在質(zhì)量濃度為0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，纖維素酶提多糖CAPF75與微波提多糖MPF75隨質(zhì)量濃度增加對金屬離子螯合力逐漸增加，最大螯合力分別為51.78%、52.77%；水提多糖WPF75與蝸牛酶提多糖SAPF75對金屬離子幾乎無螯合力。在質(zhì)量濃度0.1～2.5 mg/mL時(shí)，堿提多糖APF75對金屬子螯合力有1個(gè)平峰，最大螯合力為21.59%?；钚晕镔|(zhì)的金屬離子螯合作用一方面可避免重金屬對生物體的危害，有利于人體的健康；另一方面又可螯合對人體重要的金屬離子（鐵、鋅等），可能對人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。

結(jié)果表明，通過控制纖維素酶提多糖CAPF75和微波提多糖MPF75濃度，能夠達(dá)到較理想的金屬離子螯合作用。

3 結(jié)論與討論

由結(jié)果可知，5種不同方法提取的草菇多糖在體外對·OH、DPPH·都有較強(qiáng)的清除作用，其中纖維素酶法和微波法是2種最佳的提取抗氧化多糖的方法，其多糖得率分別為21.38%、15.56%，均具有較強(qiáng)抗氧化能力、還原能力。草菇多糖能夠清除自由基，具有一定的抗氧化作用，有望被開發(fā)成為天然的抗氧化劑，極具開發(fā)潛力和市場前景。

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