電離輻射對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞NF-κB信號通路的作用及其機(jī)制

許瑞雪 吳春明 趙永順 徐英輝

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116011)

·論著·

電離輻射對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞NF-κB信號通路的作用及其機(jī)制

許瑞雪 吳春明 趙永順 徐英輝*

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116011)

目的探討電離輻射對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)通路的作用及機(jī)制。方法電離輻射(ionizing radiation,IR)誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 T98G細(xì)胞(T98G細(xì)胞)DNA損傷；劃痕、甲基噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖及凋亡；Bay-11處理抑制NF-κB活性；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB的活性；免疫熒光檢測p65的亞細(xì)胞定位。結(jié)果電離輻射不抑制T98G細(xì)胞增殖，不誘導(dǎo)其凋亡；抑制NF-κB的活性增強(qiáng)T98G細(xì)胞對電離輻射的敏感性；電離輻射能激活T98G細(xì)胞中NF-κB信號通路。結(jié)論電離輻射能激活T98G細(xì)胞的NF-κB信號通路。抑制NF-κB可增強(qiáng)T98G細(xì)胞對電離輻射的敏感性。

膠質(zhì)瘤; 電離輻射; DNA損傷; 核轉(zhuǎn)錄因子-κB

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%，5年存活率僅為20%～30%，具有高發(fā)病率、高侵襲性、高死亡率的特點(diǎn)。放療是除了手術(shù)之外的重要治療方法，但膠質(zhì)瘤常表現(xiàn)為較強(qiáng)的放療抵抗，故臨床上治療十分棘手[1]。

研究表明腫瘤細(xì)胞對放療不敏感與NF-κB活性增高有關(guān)[2]。NF-κB在很多實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高或者呈現(xiàn)持續(xù)激活狀態(tài)，例如乳腺癌、食管癌、伯基特淋巴瘤、宮頸癌、膠質(zhì)瘤等[3,4]，而這些腫瘤普遍存在放療抵抗現(xiàn)象，預(yù)后較差。

本研究采用電離輻射(ionizing radiation,IR)模擬膠質(zhì)瘤放療內(nèi)環(huán)境，探討DNA損傷后，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB的活性變化及其對細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響，為闡明膠質(zhì)瘤放療抵抗的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞系、質(zhì)粒、抗體和試劑

人乳腺癌細(xì)胞系(Michigan cancer foundation-7,MCF-7)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(minimum essential medium,MEM)，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G培養(yǎng)于含10%胎牛血清的改良的Eagle培養(yǎng)基(Dullbecco's modified Eagle medium,DMEM)。報(bào)告基因質(zhì)粒(pNF-κB-Luc)：帶有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Clontech公司)。p65、Bcl-xL、p50及p-IκBα抗體(Santa Cruz公司)；H2AX-γ抗體(美國CST公司)；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)。

二、劃痕試驗(yàn)

MCF7及T98G細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞融合度為95%時(shí)給予電離輻射。用 Tip頭劃痕后，于0 h、20 h或30 h后記錄細(xì)胞情況。劃痕未愈合率(%)=100%-相對遷移距離(%)。

三、細(xì)胞凋亡檢測

MCF7及T98G給予電離輻射(10 Gy)處理后6 h，收細(xì)胞，膜連蛋白V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色。

四、甲基噻唑藍(lán)(methy thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞以103/孔接種于96孔板。在37℃，5% CO2孵育24 h，加入NF-κB抑制劑Bay11(5 μ mol/L)并給予電離輻射處理。加藥后4 h，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，24 h，48 h后進(jìn)行MTT檢測。存活率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)×100。

五、實(shí)時(shí)PCR

用Trizol提取總RNA，用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用SBRY Premix Ex Taq PCR試劑盒配制反應(yīng)體系。采用2-△△CT計(jì)算目的基因表達(dá)量。

六、雙熒光素酶檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染pNF-κB報(bào)告質(zhì)粒及pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒28 h后給予電離輻射處理，處理后8 h收細(xì)胞，用雙熒光素酶檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

七、Western blot

經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離提取蛋白后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜上。脫脂奶粉封閉，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育2 h。TBST緩沖液(tris buffer solution tween,TBST)洗3次后用ECL發(fā)光試劑盒(ECL Western Blotting KIT)顯色。

八、免疫熒光檢測

將T98G細(xì)胞用細(xì)胞輻照儀進(jìn)行輻照處理(10 Gy)后，置于37℃培養(yǎng)30～60 min。4%多聚甲醛固定，0.2% Trixton X-100透化，5% BSA封閉液室溫封閉，一抗37℃孵育45 min，熒光標(biāo)記的二抗37℃孵育35 min，封片后用熒光顯微鏡觀察。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、IR能誘導(dǎo)T98G細(xì)胞DNA損傷

磷酸化H2AX(H2AX-γ)是DNA損傷的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)以未照射組為陰性對照，以喜樹堿(Camptothecin,CPT)處理組為陽性對照。結(jié)果所示，IR處理后30 min，H2AX-γ特異性增強(qiáng)，表明實(shí)驗(yàn)所用的輻照方法造成了DNA損傷(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測H2AX-γ
Fig 1 Immunostaining analysis for H2AX-γ
A:Control group; B:CPT group; C:IR group.

二、T98G細(xì)胞對IR誘導(dǎo)的凋亡不敏感

放療敏感細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞MCF7在給予輻照處理后，劃痕愈合能力被明顯抑制，而輻照對T98G細(xì)胞的劃痕愈合能力無明顯影響(圖2)。

IR能促使MCF7細(xì)胞發(fā)生凋亡(bPlt;0.01)，但對T98G細(xì)胞則無明顯影響(圖3)。綜上所述，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G對IR處理不敏感。

三、抑制NF-κB活性增強(qiáng)T98G細(xì)胞對IR的敏感性

T98G細(xì)胞給予IR處理同時(shí)添加NF-κB抑制劑Bay11后，T98G細(xì)胞的劃痕愈合能力(圖4 A,B)及增殖能力都顯著下降(圖4 C)，表明抑制NF-κB的活性可增強(qiáng)T98G細(xì)胞對IR的敏感性。

四、IR能激活T98G細(xì)胞中NF-κB信號通路

熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示T98G細(xì)胞給予IR處理后，NF-κB的活性顯著增強(qiáng)，且與IR呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(圖5A)。Western Blot結(jié)果顯示IR處理明顯增強(qiáng)了IκBα的磷酸化水平，而IκBα的總量則隨著IR劑量的增加而降低(圖5B)。IR處理并不改變p50及p65的表達(dá)量(圖5C)，但能促進(jìn)p65入核(圖5D)。上述結(jié)果表明IR處理能激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路，誘導(dǎo)IκBα的磷酸化及降解，從而釋放NF-κB(p50，p65)進(jìn)入細(xì)胞核啟動靶基因表達(dá)。

圖2 IR處理后不同細(xì)胞株的劃痕愈合能力
Fig 2 Would-healing analysis after IR treatment
A:The migrated distance of MCF7 cells after exposure to IR at 0 h and 30 h; B:The migrated distance of T98G cells after exposure to IR at 0 h and 30 h; C:Quantitative analysis of the migrated distance

aPlt;0.05,vsIR untreated group at 30 h.

圖3 IR處理后細(xì)胞凋亡檢測
Fig 3 Annexin V/PI double-staining assays after IR treatment
A:IR-untreated MCF7 cells; B:IR-treated MCF7 cells; C:IR-untreated T98G cells; D:IR-treated T98G cells; E:The percentage of Annexin V+ cells from three independent experiments

bPlt;0.01,vsIR-untreated MCF7 cells.

圖4 抑制NF-κB活性增強(qiáng)T98G細(xì)胞對DNA損傷的敏感性
Fig 4 Inhibition of NF-κB activity decreases migration and proliferation of T98G cells
A:Wound-healing analysis for T98G cells after IR and Bay-11 treatment; B:Quantitation of the migrated distance (aPlt;0.05,vsIR-treated and Bay11-untreated group at 20 h ); C:MTT assays for T98G cells after IR and Bay-11 treatment (aPlt;0.05,vsIR-treated and Bay11-untreated group at 24 h;bPlt;0.01,vsIR-treated and Bay11-untreated group at 48 h).

圖5 IR處理增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB的活性
Fig 5 IR induced NF-κB activation in T98G cells
A:NF-κB luciferase activity analysis after IR treatment; B:Western blot analysis for p-IκBα and IκBα in T98G cells; C:Western blot analysis for p65 and p50 in T98G cells; D:Immunostain analysis for p65 with or without IR treatment.

bPlt;0.01,vs0 Gy group;cPlt;0.001,vs0 Gy group.

討 論

核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下，與核因子kappaB抑制蛋白(NF-kappaB inhibitor alpha,IκBα)結(jié)合而滯留在細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會啟動相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路，磷酸化IκBα并使其發(fā)生泛素化降解，釋放出的NF-κB得以入核行使其轉(zhuǎn)錄因子功能，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)[5]。經(jīng)典NF-κB信號通路的傳導(dǎo)是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的級聯(lián)反應(yīng)。其調(diào)控的基因種類多樣，包括免疫和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因，細(xì)胞粘附因子等。因此，NF-κB與多種正常或疾病狀態(tài)，如免疫、炎癥、腫瘤等相關(guān)[5～7]。持續(xù)活化的NF-κB通過刺激細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等途徑促使腫瘤產(chǎn)生放化療抵抗[8,9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明DNA損傷能激活人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中NF-κB信號通路，抑制NF-κB活性能增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對DNA損傷的敏感性。提示NF-κB信號通路在膠質(zhì)瘤放療抵抗中發(fā)揮重要作用，特異性抑制NF-κB的活性有望增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的放療敏感性，為有效治療膠質(zhì)瘤提出新的思路。

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IonizingradiationinducesNF-κBactivationinhumanglioblastomacells

XURuixue,WUChunming,ZHAOYongshun,XUYinghui

DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China

ObjectiveThe effects of ionizing radiation-induced nuclear factor-kappa B(NF-κB) activation in human glioblastoma cells are discussed.MethodsIonizing radiation (IR) was performed to induce DNA damage. Wound healing,methy thiazolyl tetrazolium (MTT) and annexin V and PI double-staining assays were used to detect cell migration,proliferation and apoptosis,respectively. Bay-11 treatment was performed to inhibit NF-κB activity. Dual-luciferase assays were performed to detect NF-κB activity. The nuclear translocation of p65 was detected by immunofluorescence.ResultsIR treatment had no significant effect on cell migration,proliferation or apoptosis in T98G cells. However,incubation with a NF-κB inhibitor Bay11 attenuated migration and proliferation in T98G cells upon IR exposure.ConclusionIR-induced NF-κB activation contributes to radioresistance in human glioblastoma cells T98G.

Glioblastoma; Lonizing radiation; DNA damage; NF-κB

1671-2897(2016)15-313-04

R 739

A

許瑞雪，副主任醫(yī)師，E-mail:xrx1976@163.com

*通訊作者：徐英輝，教授，E-mail:yinghuixu2013@126.com

2015-04-20；

2015-07-20)