新疆南疆驢源H3N8亞型EIV NA基因序列分析

劉永宏，張路瑤，李飛，趙麗

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

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新疆南疆驢源H3N8亞型EIV NA基因序列分析

劉永宏，張路瑤，李飛，趙麗

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】明確新疆南疆驢是否感染EIV，及EIV NA基因特征?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank登錄的EIV基因序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，針對(duì)新疆南疆地區(qū)2個(gè)驢屠宰點(diǎn)33份驢肺進(jìn)行EIV NA基因RT-PCR擴(kuò)增、電泳分析、膠回收、測(cè)序及序列分析?！窘Y(jié)果】中國(guó)新疆南疆驢源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株NA基因長(zhǎng)1 413 bp，編碼470個(gè)氨基酸。與國(guó)內(nèi)外H3N8亞型EIV參考毒株核苷酸同源性為75.2%～99.6%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株氨基酸同源性為80%～100%，與國(guó)內(nèi)毒株、哈薩克斯坦毒株和印度毒株在一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一一個(gè)驢源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù)和分布位置完全一致。【結(jié)論】新疆南疆存在驢感染EIV，可能為國(guó)內(nèi)疫情的延續(xù)或周邊國(guó)家傳入。

驢；馬流感病毒；H3N8亞型

0 引 言

【研究意義】馬流行性感冒，簡(jiǎn)稱馬流感(Equine influenza, EI)，是由馬流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起馬、驢和騾的一種高度接觸性呼吸道傳染病[1，2]，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該病毒還感染犬和豬[3，4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE將其列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為三類動(dòng)物疫病[5]。馬流感病毒屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬(Influenza virus A)。目前A型流感病毒根據(jù)HA分為16個(gè)亞型(H1～H16)，而NA分為9個(gè)亞型(N1～N9)。從系統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)角度分別對(duì)HA和NA基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，所獲結(jié)果也為上述分類提供了佐證[6]。EIV有2個(gè)亞型，分別是H7N7亞型EIV(即馬甲1型)和H3N8亞型EIV(即馬甲2型)[1，7，8]。馬流感的頻繁暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)馬業(yè)，尤其賽馬業(yè)危害極其嚴(yán)重，已在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)歷史上至少發(fā)生4次馬流感大流行，即1974年由H7N7亞型EIV引起的首次大流行，當(dāng)時(shí)首先從新疆開(kāi)始，然后向南向東傳播蔓延至17個(gè)省(市)、自治區(qū)，自此之后H7N7亞型EIV在中國(guó)馬群中再未分離到；1989～1990年，在吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古連續(xù)2次暴發(fā)馬流感疫情；1992～1994年，我國(guó)西部、西北、華北和西南等地區(qū)馬群中暴發(fā)馬流感疫情；2007年，新疆、甘肅相繼暴發(fā)了馬流感疫情，并迅速蔓延傳播到華北地區(qū)。后3次馬流感疫情均由H3N8亞型EIV引起[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，新疆及新疆周邊鄰國(guó)存在馬流感疫情[10-12]，這對(duì)當(dāng)前新疆地區(qū)馬屬動(dòng)物的威脅十分巨大?？紤]新疆南疆特殊的氣候環(huán)境和地域地貌因素，有必要深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究對(duì)新疆南疆驢肺組織病料進(jìn)行EIV核酸檢測(cè)，并對(duì)EIV NA基因進(jìn)行序列分析，為新疆南疆該病的防制提供依據(jù)，具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料

33份驢肺組織病料，來(lái)自2015年新疆南疆地區(qū)2個(gè)驢屠宰點(diǎn)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Trizol invitrogenTM(Code No.：15596-026)，購(gòu)自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.：DRR019A)，PremixTaq? Version2.0(Code No.：D331A)和DNA Marker2000，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit(Code No.：DP209)，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司等。

1.1.3 引物

按照引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的保守的馬屬動(dòng)物H3N8亞型EIV和H7N7亞型EIV的NA基因全序列為參照設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列為5ˊ-AGCAAAAGCAGGAGATTAAAATG-3ˊ，5ˊ-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCATT-3ˊ，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.4 參考毒株

國(guó)內(nèi)外具有代表性的39個(gè)EIVNA基因全序列，均來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，列出毒株詳細(xì)信息。表1

表1 參考毒株
Table1 Reference isolates

No．序號(hào)毒株名稱StrainName登錄號(hào)GenBankaccessionnumbersGenBank宿主Host備注Remarks1A/equine/Xinjiang/1/2015(H3N8)未登錄donkey中國(guó)新疆南疆2A/equine/Yokohama/aq5/2011(H3N8)AB727556horse日本3A/equine/Santiago/77(H7N7)AY383757Equine智利4A/equine/Cordoba/18/1985(H3N8)CY032303Equine阿根廷5A/equine/Austria/421/1992(H3N8)CY032351Equine奧地利6A/equine/Switzerland/173/1993(H3N8)CY032359Equine瑞士7A/equine/Roma/5/1991(H3N8)CY032367Equine意大利8A/equine/Switzerland/1118/1979(H3N8)CY032383Equine瑞士9A/equine/Romania/1/1980(H3N8)CY032391Equine羅馬尼亞10A/equine/SaoPaulo/1/1969(H3N8)CY032399Equine巴西11A/equine/Fontainbleu/1/1979(H3N8)CY032407Equine法國(guó)12A/equine/Berlin/1/1989(H3N8)CY032415Equine德國(guó)13A/equine/Uruguay/1/1963(H3N8)CY032423Equine烏拉圭14A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)CY032947Equine阿爾及利亞15A/equine/Johannesburg/1/1986(H3N8)CY032955Equine南非16A/equine/SaoPaulo/4/1976(H7N7)CY036881Equine巴西17A/equine/Uruguay/1063/1976(H7N7)CY036889Equine烏拉圭18A/equine/Argentina/1/1977(H7N7)CY036897Equine阿根廷19A/equine/NewMarket/nasalwash1/1979(H3N8)CY096901Equine美國(guó)20A/equine/Prague/1/1956(H7N7)CY096909Equine捷克21A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)CY096917Equine日本22A/equine/InnerMongolia/8/2008(H3N8)EU794529horse中國(guó)23A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)EU794537horse中國(guó)24A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)EU794545horse中國(guó)25A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)EU794577donkey中國(guó)26A/equine/Lonquen/1/2006(H3N8)EU926630Equine智利27A/equine/Newmarket/1/1993(H3N8)FJ375222horse聯(lián)合王國(guó)28A/Equine/Jilin/1/89(H3N8)FLANAJILINhorse中國(guó)29A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)GU571145Equine中國(guó)30A/equine/Colorado/10/2007(H3N8)HQ993105Equine美國(guó)31A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)JN674068horse印度

表1 參考毒株

續(xù)表1

Table1 Reference isolates

1.1.5 儀器

PCR儀(TC-5000, Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(jī)(R134a, Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S, 北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取

從驢肺組織病料中提取總RNA，按Trizol invitrogenTM試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng)

總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒，利用實(shí)驗(yàn)室已合成的NA基因特異性引物，進(jìn)行一步法擴(kuò)增NA基因片段，退火溫度均為54℃。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化回收

取NA基因片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收純化。

1.2.4 測(cè)序

將純化產(chǎn)物標(biāo)記后送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為NA基因擴(kuò)增引物。

1.2.5 序列分析

搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中部分EIV NA基因全序列和該實(shí)驗(yàn)獲得的NA基因全序列，用DNAStar軟件EditSeq程序?qū)⑵浜塑账岷桶被嵝蛄蟹謩e保存為*.Seq和*.Pro格式文件，應(yīng)用該軟件MegAlign程序Clustal W法進(jìn)行比對(duì)，然后在Veiw菜單中Sequence Distance和Phylogenetic Tree提取序列比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)圖。同時(shí)結(jié)合毒株時(shí)空分布，分析中國(guó)新疆南疆地區(qū)驢源EIV來(lái)源及演變特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 EIV NA基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

研究的33例樣品，根據(jù)NA基因特異性引物RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，結(jié)果顯示其中2份病料為陽(yáng)性，擴(kuò)增片段約1.4kb，與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度一致，陰性對(duì)照成立。圖1

2.2 中國(guó)新疆南疆EIV NA基因核苷酸序列分析

經(jīng)對(duì)其NA基因測(cè)序及序列比對(duì)分析，中國(guó)新疆南疆驢源EIV為H3N8亞型，命名為A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)，其NA基因包括一個(gè)完整閱讀框架長(zhǎng)1 413 bp。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一一個(gè)驢源NA全基因毒株，即中國(guó)新疆2007年毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)核苷酸同源性為99.4%；與中國(guó)毒株核苷酸同源性最高的為2007年中國(guó)新疆馬源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)，同源性為99.6%；與中國(guó)毒株核苷酸同源性最低的為1989年中國(guó)吉林A/Equine/Jilin/1/89 (H3N8))株，同源性為75.2%；國(guó)外毒株與其核苷酸同源性最高的毒株為印度2008年毒株A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)，同源性達(dá)99.2%；國(guó)外毒株與其核苷酸同源性最低的毒株為阿爾及利亞A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)株，同源性為90.2%。以上所述均為H3N8亞型EIV毒株，與H7N7亞型EIV毒株核苷酸同源性為44.0%～45.7%。

根據(jù)NA基因核苷酸全序列基因進(jìn)化樹(shù)顯示，囊括22個(gè)國(guó)家的40個(gè)EIV毒株被劃分2個(gè)大的分支，一個(gè)分支為H3N8亞型EIV毒株，另一個(gè)分支為H7N7亞型EIV毒株，A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)被劃分到H3N8亞型分支。該研究毒株與2007年新疆1個(gè)馬源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)和1個(gè)驢源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)，以及2007年華北1個(gè)毒株A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)在一個(gè)小的進(jìn)化分支內(nèi)。其次，與2013年中國(guó)徐州A/equine/Xuzhou/01/2013(H3N8)株、2012年哈薩克斯坦A/equine/Kostanay/09/2012(H3N8)株、2008年印度A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)株和2008年中國(guó)廣西A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株進(jìn)化關(guān)系也非常近。圖1

M：Maker；1：陰性對(duì)照；2～3：NA基因

2.3 中國(guó)新疆南疆EIV NA基因氨基酸序列分析

中國(guó)新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的NA基因編碼470個(gè)氨基酸，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一一個(gè)驢源NA全基因毒株，即中國(guó)新疆2007年毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)氨基酸同源性為99.6%；與國(guó)內(nèi)毒株氨基酸同源性最高的為2008年中國(guó)內(nèi)蒙古A/equine/Inner Mongolia/8/2008(H3N8)株、2007年新疆A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)株和2007年中國(guó)華北A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)株，同源性均為100%；與中國(guó)毒株氨基酸同源性最低的為1989年中國(guó)吉林A/Equine/Jilin/1/89(H3N8)株，同源性為80%；國(guó)外毒株與其氨基酸同源性最高的毒株為哈薩克斯坦2012年毒株A/equine/Kostanay/09/2012(H3N8)，同源性達(dá)99.1%；國(guó)外毒株與其氨基酸同源性最低的毒株為阿爾及利亞A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)株，氨基酸同源性為88.7%。以上所述均為H3N8亞型EIV毒株，與H7N7亞型EIV毒株氨基酸同源性為38.6%～39.0%。

圖2 馬流感病毒毒株NA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene of EIV isolated

中國(guó)新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)NA氨基酸序列含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于N39ET、N54ET、N67TS、N84NT、N144GT、N293WT和N398WS位，與毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù)和分布位置均相同。

注：糖基化是糖鏈以N-糖苷鍵結(jié)合在Asn(天冬酰胺)-X-Thr/Ser的Asn殘基上，X為除脯氨酸外的任一氨基酸殘基。

3 討 論

通過(guò)對(duì)新疆南疆驢肺組織病料進(jìn)行EIV核酸檢測(cè)及NA序列分析，證實(shí)中國(guó)新疆南疆目前驢體內(nèi)存在H3N8亞型EIV。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)與中國(guó)新疆2007年驢源毒株核苷酸同源性為99.4%；與中國(guó)毒株核苷酸同源性最高的為2007年中國(guó)新疆毒株，達(dá)99.6%；與國(guó)外毒株核苷酸同源性最高的為印度2008年毒株，同源性達(dá)98.9%。HA基因核苷酸全序列基因進(jìn)化樹(shù)也顯示，研究毒株與新疆2007年1個(gè)馬源毒株和1個(gè)驢源毒株，以及2007年1個(gè)中國(guó)華北毒株在一個(gè)小的進(jìn)化分支內(nèi)。其次，與2013年中國(guó)徐州株、2012年哈薩克斯坦株、2008年印度株和2008年中國(guó)廣西株進(jìn)化關(guān)系也非常近。由上述結(jié)果分析得出，新疆南疆驢源毒株可能為早些時(shí)間中國(guó)EIV毒株的延續(xù)或周邊國(guó)家毒株跨境或季風(fēng)原因傳播擴(kuò)散。

NA蛋白由基因組片段6編碼，是馬流感病毒另一個(gè)主要表面抗原，其成分為整體膜糖蛋白。寡糖鏈對(duì)NA的功能有重要影響，如果缺乏糖基化，NA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和酶活性都會(huì)受到影響[8，13，14]。中國(guó)新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)NA氨基酸序列含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，與唯一的一個(gè)驢源毒株糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù)和分布位置完全一致。

H3N8亞型EIV能從馬跨越種間障礙傳播給狗和豬[3-4]，是因?yàn)镠3N8亞型EIV屬于A型流感病毒，可感染多種哺乳動(dòng)物，并在宿主間進(jìn)行廣泛傳播[15-17]。馬業(yè)相關(guān)單位重視對(duì)馬屬動(dòng)物馬流感疫情的監(jiān)測(cè)，以及哺乳動(dòng)物馬流感病毒的監(jiān)測(cè)，為馬業(yè)的健康長(zhǎng)期發(fā)展提供保障。

4 結(jié) 論

根據(jù)NA基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果及其所得序列分析結(jié)果可知，新疆南疆存在驢感染EIV；根據(jù)NA基因遺傳演化分析結(jié)果顯示，新疆南疆現(xiàn)存的驢源EIV為國(guó)內(nèi)疫情的延續(xù)或周邊國(guó)家傳入。

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Fund project:Supported by NSFC(31460655)and Open project of key laboratory of Tarim animal husbandry science and technology of Xinjiang Production & Construction Corps(HS2014011)

Sequence Analysis of NA Gene of H3N8 EIV of Donkey in Southern Xinjiang

LIU Yong-hong, ZHANG Lu-yao, LI Fei, ZHAO Li

(College of Animal Science, Tarim University / Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science andTechnologyofXinjiangProduction&ConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 In order to clarify whether donkeys were infected with EIV in Southern Xinjiang and the characteristics of NA gene of EIV.【Method】According to the sequence of NA gene in GenBank, we designed and synthesized 1 pair of primers. The NA gene was obtained by RT-PCR for the suspected cases infected with EIV in Southern Xinjiang. Then the electrophoresis analysis, gel recovery, sequencing and sequence analysis were utilized.【Result】The results showed that HA gene of A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8) strain was 1,413 bp in length, encoding 470 amino acids. The homology of the nucleotide sequence and the amino acid sequence with domestic and foreign reference strains was 75.2%～99.6%% and 80%～100% respectively. The strain with the Chinese strains 、 Kazakhstan strain India strain in the same evolutionary branching. Amino acids of glycosylation site was completely consistent with A/donkey/Xinjiang/5/2007 (H3N8), the only one strain from donkey in the GenBank database.【Conclusion】There is a donkey EIV infection in Southern Xinjiang, which may be a continuation of the domestic epidemic or might be introduced from neighboring countries. This study has certain significance for the disease prevention and control in Southern Xinjiang.

donkey; EIV; H3N8 subtype

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.024

2016-03-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460655)；兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(HS2014011)

劉永宏(1981-)，男，內(nèi)蒙古武川人，副教授，博士，研究方向?yàn)榧倚蟛±韺W(xué)，(E-mail)lyhdky@126.com

趙麗(1982-)，女，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病與免疫病理學(xué)，(E-mail)zhaolidky@126.com

S855.3

A

1001-4330(2016)08-1539-07