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    香煙煙霧提取物對大鼠主動脈平滑肌細胞遷移的影響

    2016-11-26 07:29:28屈寶澤劉奇峰
    中國老年學雜志 2016年20期
    關(guān)鍵詞:香煙煙霧平滑肌

    屈寶澤 游 陸 劉奇峰

    (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,遼寧 錦州 121001)

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    香煙煙霧提取物對大鼠主動脈平滑肌細胞遷移的影響

    屈寶澤 游 陸 劉奇峰

    (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,遼寧 錦州 121001)

    目的 探討香煙煙霧提取物(CSE) 對大鼠A10主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)遷移的影響及可能機制。方法 體外培養(yǎng)大鼠VSMC,并分為空白對照組及CSE組,其中CSE組給予5%CSE處理24 h,應用Transwell方法檢測兩組VSMC的遷移能力;應用RT-PCR 和 Western 印跡方法檢測兩組骨橋蛋白(OPN)表達水平。結(jié)果 CSE組VSMC遷移能力較空白對照組明顯增強;同時CSE組OPN mRNA及蛋白表達均較空白對照組明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 CSE能夠促進大鼠VSMC的遷移,其機制可能與上調(diào)OPN表達有關(guān)。

    香煙煙霧提取物;血管平滑肌細胞;遷移;骨橋蛋白

    血管重塑是高血壓、冠脈介入治療術(shù)后再狹窄及動脈硬化等血管相關(guān)疾病的共同病理生理過程之一,而血管平滑肌細胞(VSMC)向內(nèi)膜下增殖與遷移是血管重塑的重要病理基礎(chǔ)〔1~3〕。吸煙是動脈粥樣硬化、高血壓等多種血管相關(guān)疾病的重要危險因素之一,參與了血管重塑的發(fā)生發(fā)展過程,但其機制尚有待研究。骨橋蛋白(OPN)是一種分泌型的糖基化磷蛋白,應用抗OPN抗體可以抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化、遷移和增殖。本研究擬應用香煙煙霧提取物(CSE)對大鼠 VSMC進行處理,觀察其對大鼠 VSMC 遷移的影響,并檢測OPN表達水平的變化,對CSE參與血管重塑的機制進行探討。

    1 材料和方法

    1.1 材料 本實驗所需香煙(美國肯塔基大學煙草健康研究所煙草研究用香煙 3R4F);胎牛血清(杭州四季青公司);大鼠A10主動脈VSMC株(美國ATCC細胞庫)、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司);OPN、α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz);Transwell試劑盒(Corning)。

    1.2 細胞培養(yǎng) VSMC采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%的胎牛血清),細胞在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2~3天換液一次。待細胞匯合度達到80%~90%時,予以傳代。

    1.3 細胞分組及方法 培養(yǎng)的VSMC分為2組:①空白對照組;②CSE組 (終濃度為5%CSE刺激24 h)。Transwell 法檢測VSMC的遷移能力。應用0.25%的胰酶消化細胞,應用10%胎牛血清無抗生素DMEM終止消化,離心800 r/min,5 min,棄上清,無血清無抗生素DMEM 1 ml重懸細胞(5×105/ml)。將含10%胎牛血清的 DMEM 600 μl加入到Transwell下室中,并將上室置于下室中,同時吸取100 μl的細胞懸液加入到上室。在條件為37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育24 h后,取出上室,用沾有PBS液的棉簽將上室中的細胞擦掉,用4℃下預冷后的95%酒精將遷移至小室濾膜外表面的細胞固定30 min后,再用蘇木素染劑染色15 min,置于1%的鹽酸酒精下分化3 s。用自來水沖洗15 min。過夜晾干上室濾膜,用刀片將其切下,滴加半滴中性樹膠于載玻片上,將下室面朝上并平鋪于載玻片上,再將半滴中性樹膠滴加到膜上,最后用蓋玻片將封片保存。于光學顯微鏡下照相,并計數(shù)遷移到下室面濾膜的VSMC,計數(shù)5個HP視野(×200)的穿膜細胞數(shù),取平均數(shù),計算VSMC遷移抑制率。

    1.4 RT-PCR法檢測OPN mRNA的表達 94 ℃ 5 min ;93 ℃ 變性30 s,OPN 54 ℃ ,GAPDH 56℃退火30 s,72 ℃ 延伸60 s,共 30 個循環(huán),最后72℃延伸10 min。擴增結(jié)束后取 5 μl PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(120 V,45 min),DNAgreen染色,凝膠自動成像分析系統(tǒng)掃描成像,以GAPDH為內(nèi)參。OPN上游引物5′-GCTGAAGCCTGACCCATCT-3′ ,下游引物5′-TCCCGTTGCTGTCCTGAT-3′; GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

    1.5 Western 印跡檢測OPN蛋白表達 加入RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5;1 mmol/L PMSF,0.1 mmol/L,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,NaVO4,10 mg/ml aprotinin,10 mg/ml LeuPePtin)200 μl裂解細胞,將蛋白濃度調(diào)至5 μg/μl。以每孔50 μg 的含量加樣,SDS-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳分離。轉(zhuǎn)膜于PVDF 膜,5%脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶500稀釋的OPN兔抗大鼠多克隆抗體,α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗體4℃孵育過夜。TTBS洗膜 5 min×3,再加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h,TTBS洗膜5 min×2,TBS洗膜5 min×1,加DAB液顯色5~10 min。凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

    1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行LSD方法。

    2 結(jié) 果

    2.1 CSE對VSMC遷移的影響 與空白對照組相比,CSE組VSMC的遷移能力明顯增強(P< 0.01)。見圖1。

    圖1 CSE對VSMC遷移的影響(×200)

    2.2 CSE對VSMC中OPN mRNA表達的影響 CSE組OPN mRNA的表達較空白對照組明顯升高(P< 0.01)。見圖2。

    圖2 OPN mRNA表達水平

    2.3 CSE對VSMC中OPN蛋白表達的影響 與空白對照組比較,CSE組OPN蛋白的表達明顯升高(P< 0.01)。見圖3。

    圖3 OPN 蛋白表達水平

    3 討 論

    隨著競爭壓力的不斷增加和飲食生活習慣的改變,高血壓、動脈粥樣硬化、血管支架術(shù)后再狹窄等血管相關(guān)疾病已經(jīng)愈來愈嚴重地威脅著人類的健康。血管相關(guān)疾病受多種危險因素的相互影響,其中包括年齡、性別、遺傳因素、糖尿病、脂代謝紊亂、吸煙等,其中吸煙被公認為是此類疾病的主要危險因素〔4,5〕。近年來,吸煙與血管相關(guān)疾病的相關(guān)性研究已經(jīng)越來越引起人們的重視,但其相關(guān)機制仍未完全明確。

    血管重塑是血管相關(guān)疾病的共同病理生理過程。血管重塑是指血管壁在局部生長因子、血管活性物質(zhì)及血流動力學等的共同作用下,管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主動過程,其主要特征是內(nèi)皮細胞功能紊亂、VSMC的增殖和遷移以及細胞外基質(zhì)(ECM)的沉積。其中,血管中膜平滑肌細胞向內(nèi)膜下遷移與增殖是血管重塑的主要病理基礎(chǔ)之一。

    隨著對吸煙與血管相關(guān)機制研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)吸煙可促進VSMC增殖。有學者報道其可能與吸煙引起血管活性因子如結(jié)締組織生長因子、內(nèi)皮素、血管內(nèi)皮生長因子等的大量釋放有關(guān)〔6~8〕,其機制可能與有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)等信號傳導通路有關(guān)〔9〕。但目前國內(nèi)外關(guān)于吸煙對VSMC遷移影響的相關(guān)研究尚少見。本研

    究表明CSE能夠顯著促進VSMC的遷移,并進而介導血管重塑。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同,將VSMC分為收縮型和合成型,生理狀態(tài)下的VSMC呈收縮表型。而VSMC增殖、遷移的必要條件為VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)換為合成表型。OPN是一種重要的細胞外基質(zhì)蛋白,參與了骨代謝、炎癥、腫瘤生長及免疫代謝等多種生命現(xiàn)象〔10~12〕。近年來,研究發(fā)現(xiàn)血管受損后其新生內(nèi)膜中的OPN表達水平顯著上調(diào)〔13〕。因此,OPN被認為是血管重塑過程中重要的始動因素。本實驗表明CSE可通過上調(diào)OPN表達從而促進VSMC的遷移。

    1 Li G,Chen SJ,Oparil S,etal.Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries〔J〕.Circulation,2000;101(12):1362-5.

    2 Schwartz RS,Henry TD.Pathophysiology of coronary artery restenosis〔J〕.Rev Cardiovasc Med,2002;3(suppl 5):4-9.

    3 Xu Y,Arai H,Murayama T,etal.Hypercholesterolemia contributes to the development of atherosclerosis and vascular remodeling by recruiting bone marrow-derived cells in cuff-induced vascular injury〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2007;363(3):782-7.

    4 Ambrose JA,Barua RS.The pathophysiology of cigarette smoking and cardiovascular disease〔J〕.JACC,2004;43(10):1731-7.

    5 Gandini S,Botteri E,Iodice S,etal.Tobacco smoking and cancer:a meta-analysis 〔J〕.Int J Cancer,2008;122(1):155-64.

    6 張 曉,胡曉蘭,徐倉寶,等.香煙塵粒對血管平滑肌細胞增殖的作用〔J〕.中國動脈硬化雜志,2002;10(4):294-6.

    7 王朋朋,劉閨男,彭 霞.香煙提取物影響大鼠主動脈平滑肌細胞結(jié)締組織生長因子的表達〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2011;15(37):6901-4.

    8 耿 雷,劉閨男.煙草煙霧刺激通過骨橋蛋白對大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生,2010;48(8):7-9.

    9 胡 靜,徐永健,張珍祥,等.香煙煙霧提取物通過PKC途徑促進大鼠肺動脈平滑肌細胞bFGF表達〔J〕.中國病理生理雜志,2008;24(6):1228-30.

    10 Missthoun C,Zisa D,Shabbir A,etal.Myocardial oxidative stress,osteogenic phenotype and energy metabolism are differentially involved intheinitiation and early progression of delta-sarcoglycan-null cardiomyopathy〔J〕.Mol Cell Biochem,2009;321(1-2):45-52.

    11 Chagan-Yasutan H,Lacuesta TL,Ndhlovu LC,etal.Elevated levels of full-length and thrombin-cleaved osteopontin during acute dengue virus infection are associated with coagulation abnormalities〔J〕.Thrombosis Res,2014;134(2):449-54.

    12 Iwadate H,Kobayashi H,Kanno T,etal.Plasma osteopontin is correlated with bone resorption markers in rheumatoid arthritis patients〔J〕.Int J Rheumat Dis,2014;17(1):50-6.

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    〔2015-04-15修回〕

    (編輯 苑云杰/曹夢園)

    遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院科技啟動基金項目(FYK201207)

    劉奇峰(1980-),女,主治醫(yī)師,博士,主要從事冠心病的病理生理基礎(chǔ)研究。

    屈寶澤(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師,碩士生導師,主要從事冠心病的臨床防治研究。

    R543.12

    A

    1005-9202(2016)20-4971-02;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.013

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