重慶某地仔豬免疫藍耳病活疫苗的最適劑量篩選

胡昌金 ，陳 勇 ，段 兵 ，唐臣學 ，程紹偉 ，范才良*

（1.重慶市榮昌縣畜牧獸醫(yī)局，重慶 榮昌 402460；2.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶 榮昌 402460）

高致病性豬藍耳病以懷孕母豬的繁殖障礙（流產、死胎、木乃伊胎）及各年齡段豬特別是仔豬的呼吸道疾病為主要特征，現(xiàn)已成為規(guī)?；i場的主要疾病之一。2006年夏秋季節(jié)，我國發(fā)生不明原因的豬“高熱病”，2007年1月，最終確定豬“高熱病”的主要病原為變異的豬藍耳病病毒，并定名為高致病性豬藍耳病，現(xiàn)已作為我國生豬強制免疫的病種之一 其流行特點：一是流行快，發(fā)病廣，危害重，多途徑傳播，臨床表現(xiàn)復雜化，常由流產型向混合感染高熱型轉變；二是仔豬和育肥豬死亡率呈上升趨勢；三是隱性帶毒感染日趨普遍，主要表現(xiàn)為食欲下降、生產性能降低；四是繼發(fā)或混合感染呈上升趨勢；五是該病起初多發(fā)于6～8月，現(xiàn)在已經(jīng)沒有明顯的季節(jié)之分，常年發(fā)病，呼吸道是該病的主要感染途徑，應激因素可引起發(fā)病加劇。

高致病性豬藍耳病病毒（PRRSV）是變異率較高的病毒。當前我國豬群中流行的PRRSV流行株呈現(xiàn)多樣化趨勢，不同毒株之間出現(xiàn)基因重組，活疫苗毒株與流行毒株重組，一個豬場、一個豬群同時存在經(jīng)典藍耳病病毒與高致病性藍耳病病毒（HPPRRSV），并同屬于美洲型。2010年在韓國與俄羅斯等國先后發(fā)生歐洲型PRRSV流行，在香港特區(qū)的豬場中也分離到歐洲型PRRSV毒株，說明我國豬群也面臨著歐洲型PRRSV的嚴重威脅，應引起高度重視。

本試驗用不同頭份高致病性豬藍耳病活疫苗對仔豬進行免疫注射，然后用ELISA試驗檢測抗體水平，從而篩選出最適免疫劑量，為制訂仔豬的免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品及耗材。高致病性豬藍耳病活疫苗JXA1-R株（中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產，批號：1305044-2）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒（重慶業(yè)為基生物科技有限公司生產，批號：20130619005）；pH值為7.2的磷酸鹽PBS溶液。槍頭、EP管、帽子、手套，失離子水，500～1000mL試劑瓶、封膜、吸水濾紙、標記筆。

1.1.2 主要儀器。離心機、8道可調節(jié)移液器、生化培養(yǎng)箱、純水儀、單道可調節(jié)移液器、酶標儀、電子天平等。

1.2 試驗方法

1.2.1 確定試驗動物。2013年9月，選擇榮昌縣清升鎮(zhèn)5個、遠覺鎮(zhèn)8個小型養(yǎng)殖場符合免疫條件的30日齡左右的仔豬，每窩隨機抽取3頭檢查血清中的母源抗體含量。把母源抗體全為陰性和臨床檢查健康的仔豬作為試驗對象。按照榮昌縣豬瘟、藍耳病、口蹄疫三針同時免疫的操作方式進行免疫注射，免疫后佩戴耳標并作好記錄。

1.2.2 試驗分組。見表1。

1.2.3 采血并分離血清。分別在注射疫苗后28、60d，對被免仔豬進行前腔靜脈采血、分離血清，統(tǒng)一編號送至實驗室保存、備檢。各血清樣本見表2。

表1 試驗分組

表2 樣本編號

1.2.4 用ELISA方法檢測免疫效果。首先對74個樣本進行抗體檢測，篩選出陽性血清，然后在所有陽性血清中按1、2、4頭份隨機抽樣各5份進行血清倍比稀釋，再次做ELISA血清檢測，觀察免疫后的相對抗體滴度。檢測方法：一個血清稀釋板全部加入25μL pH值為7.2的磷酸鹽PBS溶液，然后分別在第一孔加入被檢血清 25 μL，混勻，取出 25 μL稀釋的血清放入第二孔，依次稀釋，最后25μL棄之。

血清倍比稀釋情況如下：1頭份按1、2、4倍稀釋共 15 個樣，隨機抽樣的編號為：16、29、43、57、70；2頭份按1、2、4、8倍稀釋共20個樣，隨機抽樣的編號為：6、12、30、48、62；4 頭份按 1、2、4、8、16 倍稀釋共25 個樣，隨機抽樣的編號為：2、40、54、63、67。

2 試驗結果

2.1 陽性血清篩選 結果見表3。由表3的吸光度可知7個為陰性，其中1頭份6個，2頭份1個；其他全為陽性。

2.2 免疫后相對抗體滴度的檢測 由表4的吸光度可知：1頭份1倍稀釋的有3個陽性、2個陰性，2倍稀釋、4倍稀釋的都為陰性；2頭份1、2倍稀釋的全為陽性，4倍稀釋的有3個為陽性、2個為陰性，8倍稀釋的全部為陰性；4頭份1、2倍稀釋的全為陽性，4倍稀釋的有4個為陽性、1個為陰性，8、16倍稀釋的全部為陰性。

2.3 生物學統(tǒng)計結果 由表5分析得出：注射高致病性豬藍耳病活疫苗1頭份與2頭份之間的免疫效果差異顯著，注射2頭份與4頭份之間的差異性不顯著。

表3 吸光度

表4 吸光度

表5 方差分析P值

表6 方差分析P值

由表6可知，注射1頭份高致病性豬藍耳病活疫苗后28d和60d，抗體效果差異性顯著；注射2頭份、4頭份后28d和60d，抗體效果差異性不顯著。

3 分析與討論

3.1 從本試驗結果可知，注射高致病性豬藍耳病活疫苗1頭份與2頭份間的抗體滴度的差異性顯著，注射2頭份與4頭份間的差異性不顯著。1頭份免疫后在28d和60d所產生抗體的差異性顯著，而2頭份、4頭份分別在28d和60d所產生的抗體差異不顯著。說明免疫1頭份的抗體水平不能達到堅強的免疫保護力。分析其原因可能是：（1）被免豬只處于亞健康狀態(tài)或者因飼養(yǎng)管理水平存在差異使被免豬只產生免疫應答不完全；（2）三針同時免疫可能存在疫苗之間相互干擾的現(xiàn)象[3]；（3）嚴格按照標準劑量1mL免疫可能出現(xiàn)疫苗注射操作不當而致藥量注射不足；（4）較小的劑量不能克服疫苗之間的交叉干擾，更不能激活體內免疫細胞產生較高的抗體。

3.2 高致病性豬藍耳病是一種免疫抑制性疾病，其持續(xù)性感染會在感染豬體內長期存在，成為消滅和減少PRRS在豬群中傳播的嚴重障礙，一旦發(fā)病就會導致其他疾?。ㄈ缲i瘟）的抗體水平下降，誘發(fā)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、豬支原體肺炎等疾病的混合感染或者繼發(fā)感染。因此，養(yǎng)豬場對豬瘟的免疫非常重要，應以此作為疾病防控的基礎。建議國內豬場首先需要做好豬瘟免疫，并定期檢測豬瘟抗體滴度，當豬瘟抗體滴度下降到保護水平之下時，應及時補免豬瘟疫苗，這對于因高致病性豬藍耳病暴發(fā)，降低豬只大規(guī)模死亡具有重要的作用[7]。

3.3 控制高致病性豬藍耳病在國內外的研究很多，最有效的辦法：一是加強免疫注射，國家已經(jīng)將該病納入強制免疫計劃；二是隨時對養(yǎng)殖場進行藍耳病病原學監(jiān)測，掌握帶毒情況，及時制定防控措施；三是嚴格按照動物引種程序，做好引進豬只的檢疫、隔離飼養(yǎng)、消毒等生物安全措施；四是淘汰帶毒豬只，達到凈化此病的目的[9]。

3.4 藍耳病主要參與細胞免疫，豬接種藍耳病活疫苗后3～4周才能產生保護性抗體，在此期間內如果發(fā)生感染都會導致之前的免疫失敗。由于野毒的毒力強于弱毒，導致強毒很快侵入并占得優(yōu)勢，從而引起發(fā)病。所以，很多豬場在緊急接種的過程中由于無法確定是否存在野毒潛伏感染，結果導致免疫無效，甚至出現(xiàn)免疫后發(fā)病率反而急劇增加的現(xiàn)象[8-9]。

4 結論

免疫2頭份的抗體滴度比免疫1頭份的抗體滴度高，更具有保護力，且成本低。4頭份和2頭份的抗體滴度差異不顯著，但注射4頭份的成本更高?？梢姌s昌地區(qū)在注射高致病性豬藍耳病活疫苗時，最適宜免疫2頭份劑量。

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