黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的研究

褚盼盼 李蕾 王潔 任益平 陳月桃

摘 要：該文以黑豆紅色素為試驗(yàn)材料，采用分光光度法研究了不同的pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、黑豆紅色素濃度等條件對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響，確定黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的最佳條件。結(jié)果表明，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的體外清除作用，在黑豆紅色素濃度為5.5mg/mL、pH為2.6、反應(yīng)溫度為37℃、反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí)清除率最大，達(dá)到了99.50%，高于對(duì)照Vc。

關(guān)鍵詞：黑豆紅色素；亞硝酸鹽；清除率

中圖分類(lèi)號(hào) TS264.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）19-0039-03

Abstract：Making Black beans red pigment as material， the influence of different pH， reaction temperature， reaction time， black beans red pigment concentration conditions on the nitrite scavenging effect in vitro by spectrophotometric method are studied， to ascertain the best condition of black beans red pigment removal of nitrite in vitro. Research shows that black beans red pigment of nitrite has strong influence on vitro， while the black beans red pigment concentration is 5.5 mg/mL， pH is 2.6， the reaction temperature is 37 ℃，and reaction time is 4 h， clearance reaches the largest to 99.50%， higher than controls Vc.

Key words：Black beans red pigment；Nitrite；Clearance

亞硝酸鹽是一種普遍存在于人們生產(chǎn)和生活中的物質(zhì)。在食品中，亞硝酸鹽可以作為肉制品的護(hù)色劑和增色劑，還可增加肉的風(fēng)味，同時(shí)可以作為防腐劑使用，防止及阻止肉毒梭菌的生長(zhǎng)和增長(zhǎng)肉制品的貨架期。但由于亞硝酸鹽是強(qiáng)氧化劑，其大量進(jìn)人體后會(huì)引起高鐵血紅蛋白癥，使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運(yùn)氧的功能，致使組織缺氧，出現(xiàn)青紫而中毒，還可使血管擴(kuò)張、血壓降低。另外，亞硝酸鹽被人體食入之后，會(huì)在人體內(nèi)形成亞硝胺，而亞硝胺是一種強(qiáng)烈的致癌作物質(zhì)，引起食道、胃、肝和大腸等部位的癌癥。目前，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者從植物中提取出天然活性成分對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行了清除作用的研究[1-9]。黑豆紅色素就是一種天然的、無(wú)毒無(wú)害的常用食品添加劑[10]，具有延緩衰老、保肝護(hù)肝、抗菌、抗肥胖等作用[11-14]。本文通過(guò)研究黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除的作用，研究各種反應(yīng)條件對(duì)亞硝酸鹽體外清除率的影響，確定黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的最佳條件，旨在為開(kāi)發(fā)天然植物源的亞硝酸鹽體外清除劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 黑豆紅色素，課題組自制[15]；無(wú)水乙醇、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、Vc等均為國(guó)產(chǎn)分析純。UV—1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；RE—52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭上海亞榮生化儀器廠；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海凱朗儀器設(shè)備廠；HH—6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；Neofμge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照GB 5009.33-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的分光光度法，亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定。分別吸取0（零管）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0μg/mL），分別置于25mL帶塞比色管中。分別往比色管中添加1mL對(duì)氨基苯磺酸溶液（4g/L），搖晃混合均勻，靜止放置3～5min后在依次分別加入0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）。加水至比色管上刻度線，搖晃混合均勻，靜止放置15min，用零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)538nm處測(cè)吸光度值。每組試驗(yàn)樣品做三次平行試驗(yàn)，以亞硝酸鈉濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.0256x+0.0046，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

1.2.2 不同條件下黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響

1.2.2.1 pH值 在6支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL），加入pH分別為2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于37℃下反應(yīng)1h。吸取1mL上述反應(yīng)液于比色管中，按照1.2.1的方法測(cè)定538nm處的吸光度值，并計(jì)算其亞硝酸鹽含量，然后按下式計(jì)算黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率：

清除率（%）=[（A+C-B）/A]×100

式中：A為空白實(shí)驗(yàn)反應(yīng)液的亞硝酸鹽含量，B為加入黑豆紅色素反應(yīng)液的亞硝酸鹽含量，C為用蒸餾水代替亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)的反應(yīng)液的亞硝酸鹽含量。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度 在10支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL），加入上一步試驗(yàn)得出的最適pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于20、30、37、40、50、60、70、75、77、80℃下反應(yīng)1h。吸取1mL上述反應(yīng)液，按照1.2.1的方法測(cè)定538nm處的吸光度值，并計(jì)算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計(jì)算黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.2.3 反應(yīng)時(shí)間 在14支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL），加入上一步試驗(yàn)得出的最適pH的醋酸緩沖溶液8mL，混勻后在上一步試驗(yàn)得出的最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0h。吸取1mL上述反應(yīng)液，按照1.2.1的方法測(cè)定538nm處的吸光度值，并計(jì)算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計(jì)算出黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.2.4 黑豆紅色素濃度 在12支25mL比色管中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL），加入上一步試驗(yàn)得出的最適pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于上一步試驗(yàn)得出的最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)最適的時(shí)間。吸取1mL上述反應(yīng)液，按照1.2.1的方法測(cè)定538nm處的吸光度值，并計(jì)算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計(jì)算出黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.3 黑豆紅色素與Vc對(duì)體外清除亞硝酸鹽作用的比較 取5支25mL比色管中分別加入0、4.0、4.5、5.0、 5.5mg/mL的黑豆紅色素和Vc溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL），加入pH2.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于37℃下反應(yīng)4h。吸取1mL上述反應(yīng)液，按照1.2.1的方法測(cè)定538nm處的吸光度值，并計(jì)算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計(jì)算出對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 每組試驗(yàn)重復(fù)三次，所有數(shù)據(jù)在WPS表格中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值下黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖1得出，在研究的pH值范圍（2.6～4.6）內(nèi)，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除作用隨pH值的升高而減小，在pH2.6時(shí)，體外清除率最高，達(dá)到59.44%。這表明在環(huán)境條件為酸性，接近人體胃液的條件下，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽具有較高的體外清除作用。

2.2 不同反應(yīng)溫度下黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖2得出，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除率隨反應(yīng)溫度升高清除率逐漸升高，說(shuō)明溫度對(duì)黑豆紅色素清除亞硝酸鹽有很大的影響。如果以人體內(nèi)部為前提，盡量將溫度定在接近人體的溫度。由圖2可以看出，反應(yīng)溫度在30～40℃，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除率基本變化不大，即可以參照人體的溫度，選取37℃進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同反應(yīng)時(shí)間下黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖3得出，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，反應(yīng)時(shí)間從0.5～3.0h呈現(xiàn)一個(gè)明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，而后又稍微下降之后又再升高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到4h之后，清除率基本不再增長(zhǎng)，維持在80%以下，說(shuō)明最佳的反應(yīng)時(shí)間為4h。

2.4 不同黑豆紅色素濃度對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖4得出，在不同的黑豆紅色素濃度下，黑豆紅色素濃度與對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率呈正相關(guān)關(guān)系，清除率隨黑豆紅色素濃度增大而增大。黑豆紅色素濃度在0.5～2.5mg/mL增長(zhǎng)明顯，在2.5～5.5mg/mL增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，在5.5mg/mL黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率達(dá)到最高，清除率可達(dá)99.50%。

2.5 黑豆紅色素與Vc對(duì)亞硝酸鹽體外清除作用的比較結(jié)果 由圖5可以看出，隨著Vc的濃度的升高，其對(duì)亞硝酸鹽的清除率而增大，但在同樣條件下，黑豆紅色素有明顯的優(yōu)越性。黑豆紅色素濃度為4.0mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到94.24%，而Vc僅為59.48%；黑豆紅色素在最適濃度5.5mg/mL時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的體外清除率達(dá)99.50%，Vc為80.14%。由圖5可以看出，濃度在4.5～5.5mg/mL，Vc的清除作用雖然明顯增強(qiáng)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及黑豆紅色素的清除效果。

3 結(jié)論

亞硝酸鹽經(jīng)常被用于某些食品中以增強(qiáng)其商品性，但存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)對(duì)黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的條件，如pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、黑豆紅色素濃度等進(jìn)行優(yōu)化，明確了不同條件對(duì)黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的影響作用，并得到了最佳的清除條件，即：當(dāng)黑豆紅色素濃度為5.5mg/mL時(shí)，在pH2.6下，反應(yīng)溫度為37℃下反應(yīng)4h，黑豆紅色素對(duì)亞硝酸鹽體外清除率達(dá)到99.50%。在同等條件下與Vc進(jìn)行對(duì)照比較之后，發(fā)現(xiàn)黑豆紅色素有比Vc更好的體外清除效果。黑豆紅色素不僅可以作為食品添加劑用于食品著色，也可作為亞硝酸鹽體外清除劑使用。

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（責(zé)編：張宏民）