水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留的測定

方 益，嚴忠雍，喻 亮，李佩佩，張 帥

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山 316021)

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水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留的測定

方 益，嚴忠雍，喻 亮，李佩佩，張 帥

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山 316021)

[目的]建立水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星3種氟喹諾酮類藥物殘留測定的超高效液相色譜法。[方法]以0.10%甲酸-乙腈為提取溶劑，提取液經(jīng)濃縮，正己烷凈化去脂，采用超高效液相色譜-熒光檢測器檢測3種氟喹諾酮類藥物，外標法定量。[結(jié)果]該方法的相對標準偏差為1.4%～8.1%，回收率為82%～106%，3種氟喹諾酮類藥物在0.01～1.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，方法檢出限為5.00 μg/kg。[結(jié)論]該檢測方法準確、快捷、高效，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。

超高效液相色譜；水產(chǎn)品；氟喹諾酮類

氟喹諾酮類藥物屬于合成抗生素類物質(zhì)。我國農(nóng)業(yè)部頒布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)業(yè)部2002年235號公告)[1]中規(guī)定了水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量。水產(chǎn)品養(yǎng)殖戶可能會通過添加氟喹諾酮類藥物來提高水產(chǎn)品的存活率，這易導(dǎo)致水產(chǎn)品對抗生素產(chǎn)生耐藥性，從而影響后續(xù)治療效果；如果含有抗生素類的食品在市場上銷售流通，消費者長期食用后，會對抗生素產(chǎn)生一定的耐藥性。從相關(guān)文獻報道來看，有關(guān)氟喹諾酮類藥物的檢測方法主要集中在環(huán)境和食品方面[2-4]，檢測使用的儀器方法主要為液相色譜法[5-7]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-12]。液相色譜能檢測的氟喹諾酮類藥物種類有限，而且分析時間長，普遍都需要30 min以上，檢測效率低下，試劑流動相消耗較多，不符合高通量、綠色化學(xué)檢測要求；而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因為儀器成本較高，難以推廣使用，并且準確定量能力較弱，這些因素在一定程度上制約了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在分析測定氟喹諾酮類藥物的應(yīng)用。

筆者建立了一種超高效液相法測定水產(chǎn)品中3種氟喹諾酮類藥物的檢測方法，研究并優(yōu)化了水產(chǎn)品中3種氟喹諾酮類藥物的前處理方法和儀器分離條件，以期為市售水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物的準確、快捷、高效檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試水產(chǎn)品：鯽魚、鯉魚、大黃魚、鯧魚、對蝦，市售。主要儀器：超高效液相色譜儀，美國 Waters 公司；高速離心機，德國Hettich公司；旋渦振蕩器，德國IKA公司；0.22 μm濾膜，上海安譜；超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

主要試劑：諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星，國家標準物質(zhì)中心；甲酸(純度99%)；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；娃哈哈超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取與凈化 。稱取5.00 g(精確到 0.01 g)去鱗、腮、內(nèi)臟后絞碎的水產(chǎn)品樣品，置于50 mL 離心管中，加入15.0 g無水硫酸鈉，用15 mL 酸化乙腈(1%甲酸)旋渦充分混合振蕩2 min，6 000 r/min 離心5 min，倒出上清液。殘渣重復(fù)提取 1 次，合并上清液，混勻，備用。提取液經(jīng)40 ℃以下水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準確加入初始流動相2 mL，超聲振蕩溶解殘渣，加入5 mL正己烷旋渦充分振蕩，6 000 r/min離心 5 min，吸取下層液，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.2.2 儀器條件。色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 μm×150.0 mm×1.7 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈(87.5∶12.5，V/V)，等度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，樣品室溫度4 ℃，進樣量10 μL，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件 氟喹諾酮類藥物屬于酸堿兩性化合物，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基和哌嗪基，酸性的流動相對氟喹諾酮類藥物的響應(yīng)和峰型都具有較為明顯的影響。該試驗在流動相的水相中加入甲酸來控制pH，達到了較為理想的分離度和響應(yīng)值。0.1%、0.5%、1.0%甲酸水溶液對氟喹諾酮類藥物在色譜柱上響應(yīng)值的影響結(jié)果見圖1。通過圖1得出，0.1%甲酸水溶液作為水相時各組分峰型和響應(yīng)值都較好，符合檢測要求。

圖1 不同濃度的甲酸水溶液對比色譜Fig.1 Contrast chromatography of different concentrations of formic acid aqueous solutions

圖2 不同的流動相比例對比色譜Fig.2 Contrast chromatography of different proportion of mobile phase

由于各類氟喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相近，在色譜柱上的保留時間較為接近或者重疊，故對其色譜分離帶來了一定的影響。該試驗通過優(yōu)化0.1%甲酸水溶液和乙腈的不同比例來達到較好的分離度，比較了0.1%甲酸水溶液和乙腈在80.0∶20.0、90.0∶10.0和87.5∶12.5(V/V)幾種不同比例條件下的色譜圖，見圖2。當(dāng)流動相甲酸水溶液-乙腈比例為87.5∶12.5時，各組分出峰時間較為合適，峰型較好，符合檢測要求。2.2 提取溶劑的選擇 氟喹諾酮類藥物具有酸堿兩性，對于酸性或者堿性溶液具有較好的溶解性。當(dāng)使用純?nèi)軇┮译嫣崛?，容易造成水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)沉淀，影響提取效率。如果使用磷酸鹽提取，提取液較為渾濁，雜質(zhì)較多，離心后無法澄清，凈化比較困難，影響回收率，降低了檢測效率。該試驗采用1%甲酸酸化的乙腈溶液對水產(chǎn)品進行提取，使得水產(chǎn)品中肌肉水解，增加氟喹諾酮類藥物在酸化乙腈中的溶解度，提取液含水量少，容易被水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，提高了檢測效率與回收率。

2.3 樣品定容溶劑的選擇 氟喹諾酮類藥物在色譜柱中的分離度及峰型與初始溶劑有關(guān)，當(dāng)樣品定容溶液中有機相(乙腈)比例高于色譜系統(tǒng)初始流動相比例的3倍時，較早出峰的氟喹諾酮類藥物容易造成前拖尾，故該試驗采用初始流動相來溶解旋蒸完之后的殘渣，消除溶劑的干擾。

2.4 線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度 分別配制3種氟喹諾酮類藥物濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL溶液，在“1.2.2”色譜條件下進行測定，標準溶液色譜圖見圖3。以峰面積為y值，標準溶液各濃度為x值繪制曲線。線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(S/N=3)見表1。

選取不含有氟喹諾酮類藥物的水產(chǎn)品(對蝦)，分別添加混合標準溶液，每個樣品做6次平行，按照“1.2.1”和“1.2.2”進行樣品前處理和色譜測定，計算回收率與精密度，結(jié)果見表1，空白樣品加標色譜圖和空白樣品色譜圖見圖4。由表1可見，對蝦中添加混合標準溶液濃度為10.0 μg/kg時，平均回收率為82.0%～103.2%，RSD為3.1%～8.0%；添加濃度為25.0 μg/kg時，平均回收率為87.5%～106.0%，RSD為2.4%～6.2%。

注：1．諾氟沙星；2．環(huán)丙沙星；3．恩諾沙星。Note：1.Norfloxacin；2.Ciprofloxacin；3.Enrofloxacin.圖3 標準溶液色譜Fig.3 Standard solution chromatogram

化合物Compounds檢出限D(zhuǎn)etectionlimitμg/kg添加水平Addinglevel10．0μg/kg平均回收率Averagerecoveryrate∥%RSD%25．0μg/kg平均回收率Averagerecoveryrate∥%RSD%回歸方程Regressionequation回歸系數(shù)(r2)Regressioncoefficient諾氟沙星Norfloxacin1．0099．33．197．06．2y=4．84e-7x-1．02e-50．999環(huán)丙沙星Ciprofloxacin1．0082．08．087．55．5y=4．15e-7x-2．10e-40．996恩諾沙星Enrofloxacin1．00103．25．3106．02．4y=6．63e-7x-2．26e-50．999

圖4 空白樣品加標色譜和空白樣品色譜Fig.4 Blank sample added quinolones chromatogram and blank sample chromatogram

3 結(jié)論與討論

水產(chǎn)品中含有各種蛋白質(zhì)與脂肪，成分復(fù)雜，在進行氟喹諾酮類藥物檢測時容易被干擾。該試驗通過對提取溶劑、流動相及定容溶劑的選取與優(yōu)化，成功建立了超高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留，該方法樣品的前處理操作簡便、溶劑用量少、儀器分析時間短，極大地提高了工作效率，且靈敏度和精密度可以滿足實際樣品檢測需要，尤其適合大批量樣品操作，適用于水產(chǎn)品中氟喹諾酮類殘留含量的測定，可進一步推廣應(yīng)用。

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Determination of Quinolones Residues in Aquatic Products

FANG Yi, YAN Zhong-yong, YU Liang et al

(Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Zhoushan, Zhejiang 316021)

[Objective]An ultra performance liquid chromatography method was developed for the simultaneous determination of 3 quinolone antibiotics in norfloxacin, ciproxacin, enrofloxacin. [Method] The method with 0.10% formic acid and acetonitrile as extraction solvent, the extract was concentrated and degreased by hexane, 3 kinds of quinolones antibiotics were detected by ultra-liquid chromatographic with fluorescence detector, and were quantified using external standard method. [Result] The relative standard deviations(RSD) were 1.4%-8.1%; recoveries were 82%-106%; a variety of quinolone antibiotics showed good linearity in the concentration range of 0.01-1.00 μg/mL, correlation coefficients were greater than 0.995; detection limits were 5.00 μg/kg. [Conclusion] The detection method is accurate, fast and efficient, and can be widely used in the daily detection of quinolone antibiotics in aquatic products.

Ultra performance liquid chromatography; Aquatic products; Quinolone antibiotics

浙江省科技計劃項目(2016C37026)。

方益(1986- )，男，浙江舟山人，工程師，碩士，從事獸藥殘留分析研究。

2016-08-03

S 912

A

0517-6611(2016)28-0092-02