產(chǎn)淀粉酶菌種的分離純化及培養(yǎng)條件研究

紀(jì)韋韋，張小華，高 靜

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

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產(chǎn)淀粉酶菌種的分離純化及培養(yǎng)條件研究

紀(jì)韋韋，張小華，高 靜

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

[目的]探究產(chǎn)淀粉酶菌種的分離純化及培養(yǎng)條件。[方法]從土壤中分離到1株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌A并分離純化培養(yǎng)。[結(jié)果]細(xì)菌A在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，水解圈平均直徑/菌種平均直徑(R2/R1)為2.69；在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，R2/R1為2.69；pH在7.5時(shí)產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，R2/R1為2.95。[結(jié)論]以淀粉為碳源、以硝酸鈉為氮源、pH在7.5的培養(yǎng)基有利于細(xì)菌A產(chǎn)淀粉酶能力的提高。

淀粉酶；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件

最初，淀粉酶(amylase)一詞用來(lái)指可以水解直鏈淀粉、支鏈淀粉、肝糖及其降解產(chǎn)品中α-1，4-糖苷鍵的酶，它們水解相鄰葡萄糖單體之間的鍵，產(chǎn)生葡萄糖[1]。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉 、糖元等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷鍵的酶[1]。

淀粉酶是淀粉降解酶，廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中，是人們經(jīng)常研究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，淀粉酶都有著不同規(guī)模應(yīng)用，尤其是堿性淀粉酶在各種洗滌劑產(chǎn)品中有廣泛應(yīng)用。在某種程度上，淀粉酶也被用作消化助劑，補(bǔ)充面粉的糖化活性，改善一些動(dòng)物飼料的可消化性[2-3]。由于淀粉酶應(yīng)用廣泛，大部分由微生物產(chǎn)生，筆者擬通過(guò)淀粉水解來(lái)分離篩選可產(chǎn)淀粉酶的菌體，并對(duì)其進(jìn)行研究，為今后的淀粉酶提取奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。含淀粉的細(xì)菌培養(yǎng)基：氯化鈉 0.5 g，硝酸銨 1.0 g，硫酸銨0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，淀粉 1.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，瓊脂18.0 g[4-5]。

察氏培養(yǎng)基：淀粉 30.0 g，硝酸鈉 2.0 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀 0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂20.0 g[6]。

1.1.2 儀器。玻璃棒，250 mL大燒杯，50 mL小燒杯稱量紙，天平，100 mL量筒，搪瓷缸，微波爐，pH試紙，150 mL三角瓶，培養(yǎng)皿，移液槍，20、100 μL槍頭，1 mL無(wú)菌注射器，過(guò)濾器，吸管，報(bào)紙，包扎繩，YXQ-LS-50 立式壓力蒸氣滅菌器(上海博田實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，超凈工作臺(tái) SW-CJ-2FD(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，SPX-250B-Z型 生化培養(yǎng)箱(上海博田實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，LRH-250 生化培養(yǎng)箱(上海其欣科學(xué)儀器有限公司)，高低溫?fù)u床培養(yǎng)箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.3 樣品。土壤(用直徑為3.5 cm 的土鉆采集5 鉆0 ～ 20 cm 深度土壤，混合為1個(gè)土樣，過(guò)2 mm篩后放在4 ℃冰箱保存)，發(fā)霉的馬鈴薯。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的分離。稱取1.0 g土壤，加99 mL水?dāng)嚢杈鶆?，靜置5 min，取上清液0.5 mL加入到裝有4.5 mL無(wú)菌水的試管中稀釋并混勻，重復(fù)稀釋1、2、3次，分別制得1∶104、1∶105、1∶106提取液[6-7]。

取上述提取液各0.2 mL加入到含淀粉的細(xì)菌培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中，涂布，37 ℃培養(yǎng)3 d；同時(shí)，將馬鈴薯上的霉菌接種到含淀粉的細(xì)菌培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d；將培養(yǎng)好的平皿放入4 ℃冰箱中冷藏24 h，觀察水解圈的大小[8-10]。

1.2.2 淀粉酶產(chǎn)生菌的純化。觀察冷藏過(guò)的平皿上是否產(chǎn)生透明水解圈，將具有明顯水解圈的細(xì)菌在察氏培養(yǎng)基中劃線分離，37 ℃培養(yǎng)3 d；重復(fù)上述操作，直至產(chǎn)生單菌落。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件產(chǎn)淀粉酶能力的研究。吸取3 mL 0.9%的無(wú)菌生理鹽水，將其轉(zhuǎn)移到已純化好的細(xì)菌A平皿中，制成菌懸液[10]。

1.2.3.1 不同碳源的影響。在察氏培養(yǎng)基中加入相同碳濃度的不同碳源(葡萄糖、蔗糖和淀粉)，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉(zhuǎn)移到裝有50 mL不同碳源的液體察氏培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，在設(shè)定28 ℃、80 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后取樣，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾培養(yǎng)液，再用移液槍移取20 μL無(wú)菌濾液，將其放在察氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同1.2.1。

1.2.3.2 不同氮源的影響。在察氏培養(yǎng)基中加入相同氮濃度的不同氮源(硫酸銨、硝酸鈉)，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉(zhuǎn)移到裝有50 mL不同氮源的液體察氏培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，在設(shè)定28 ℃、80 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后取樣，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾培養(yǎng)液，再用移液槍移取20 μL無(wú)菌濾液，將其放在察氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。

1.2.3.3 不同pH的影響。將察氏培養(yǎng)基pH調(diào)為6.4、7.0、7.5，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉(zhuǎn)移到裝有50 mL不同pH的液體察氏培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，在設(shè)定28 ℃、80 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后取樣，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾培養(yǎng)液，然后用移液槍移取20 μL無(wú)菌濾液，將其放在察氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的分離 在細(xì)菌培養(yǎng)基上，無(wú)論是土壤或者發(fā)霉馬鈴薯中生長(zhǎng)的菌體均沒(méi)有水解圈產(chǎn)生。而在察氏培養(yǎng)基上則出現(xiàn)了大小不一、清晰可見的水解圈。對(duì)圖1中產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌菌落進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌A菌落為黃色，質(zhì)地較硬，無(wú)黏稠感；產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌B菌落為深黃色，質(zhì)地偏軟，有黏稠感。

2.2 淀粉酶產(chǎn)生菌的純化 純化后的細(xì)菌A產(chǎn)生明顯的水解圈，如圖2所示。

經(jīng)過(guò)菌種的3次純化，從表1可以看出，第1、2、3次純化后的R2/R1分別為1.75、1.95、4.40，表明菌種越純，產(chǎn)生的淀粉酶越多，水解圈越大，酶活性越大。

注：a.第1次純化； b.第2次純化；c.第3次純化。 Note：a.The first purification；b.The second purification；c.The third purification.圖2 純化后的細(xì)菌AFig.2 Purified bacterium A

純化次數(shù)Purification菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R1第1次Thefirsttime0．400．401．000．701．750．500．700．400．600．300．50第2次Thesecondtime1．101．052．002．051．951．002．10第3次Thethirdtime0．400．451．801．984．400．502．100．502．100．401．90

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)淀粉酶能力的影響

2.3.1 不同碳源的影響。不同碳源的培養(yǎng)效果見圖3。從表2可知，經(jīng)過(guò)不同碳源的培養(yǎng)，以葡萄糖、蔗糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基R2/R1分別為0、2.42和2.69，表明細(xì)菌A不能在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，能在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但效果沒(méi)有以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上更明顯。

注：a.以蔗糖為碳源，b.以葡萄糖為碳源，c.以淀粉為碳源。 Note：a.Sucrose；b.Glucose；c.Starch.圖3 不同碳源的培養(yǎng)效果Fig.3 Effects of various carbon sources on the ability to produce amylase

碳源Carbonsource菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R1葡萄糖Glucose0．500．50000葡萄糖Glucose0．500葡萄糖Glucose0．500葡萄糖Glucose0．500蔗糖Sucrose1．001．122．202．722．42蔗糖Sucrose1．503．20蔗糖Sucrose1．002．80蔗糖Sucrose1．002．70淀粉Starch1．001．053．002．822．69淀粉Starch1．102．80淀粉Starch1．102．80淀粉Starch1．002．70

2.3.2 不同氮源的影響。不同氮源的培養(yǎng)效果見圖4。從表3可知，經(jīng)過(guò)不同氮源的培養(yǎng)，以硫酸銨、硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基R2/R1分別為2.54、2.69，表明細(xì)菌A能在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并能產(chǎn)生水解圈，以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)生的水解圈更大更明顯。

注：a.以硫酸銨為氮源，b.以硝酸鈉為氮源。 Note：a.Ammonium sulfate；b.Sodium nitrate.圖4 不同氮源的培養(yǎng)效果Fig.4 Effects of various nitrogen sources on the ability to produce amylase

2.3.3 不同pH的影響。不同pH的培養(yǎng)效果見圖5。從表4可知，經(jīng)過(guò)不同pH的培養(yǎng)，pH為6.4、7.0和7.5的培養(yǎng)基R2/R1分別為1.82、2.69和2.95，由此可知細(xì)菌A在pH為7.0、7.5的環(huán)境下R2/R1偏大，說(shuō)明細(xì)菌A在中性或偏堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛。

表3 不同氮源條件下產(chǎn)酶效果

注：a.pH為6.4 ，b.pH為7.0，c.pH為7.5。 Note：a.pH.6.4 ，b.pH.7.0，c.pH.7.5。圖5 不同pH的培養(yǎng)效果Fig.5 Influences of different pH values on the ability to produce amylase

pH菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R16．41．101．222．102．221．826．41．002．006．41．402．306．41．402．507．01．001．053．002．822．697．01．102．807．01．102．807．01．002．707．51．001．053．003．102．957．50．903．207．51．102．907．51．203．30

3 結(jié)論與討論

(1)產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌A在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，在以蔗糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上R2/R1分別為2.42和2.69，由此可知細(xì)菌A在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈最大，說(shuō)明細(xì)菌A在淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好。

(2)細(xì)菌A在以硫酸銨、硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上R2/R1分別為2.54、2.69，說(shuō)明細(xì)菌A在這2種氮源上都能生長(zhǎng)，以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基更適合細(xì)菌A的生長(zhǎng)。

(3)細(xì)菌A在pH為6.4、7.0和7.5的培養(yǎng)基上R2/R1分別為1.82、2.69和2.95，說(shuō)明pH在6.4～7.5，隨著pH的增大，R2/R1不斷增大，細(xì)菌A的活性也越來(lái)越大。

綜上所述，細(xì)菌A在以淀粉為碳源、硝酸鈉為氮源、pH在7.5時(shí)R2/R1偏大，在此培養(yǎng)基上細(xì)菌A的生長(zhǎng)旺盛。

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Study on Separation, Purification and Culture Conditions of an Amylase Producing Strain

JI Wei-wei, ZHANG Xiao-hua, GAO Jing

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Jurong, Jiangsu 212400)

[Objective] To explore the separation, purification and culture conditions of an amylase producing strain. [Method] Bacterium A, which had a strong ability to produce amylase, was isolated from the soil and then purified and cultured. [Result] Bacterium A had the strongest ability to produce amylase in the medium using starch as the carbon source, and the ratio of the average diameter of hydrolyzation circlesR2to the average diameter of the strainR1(calledR2/R1for short) was 2.69; when being cultured in the medium using sodium nitrate as the nitrogen source, bacterium A had the strongest ability to produce amylase, andR2/R1was 2.69; as the pH of the medium was 7.5, the ability to produce amylase was the strongest, andR2/R1was 2.95. [Conclusion] Bacterium A should be cultured in the medium where starch and sodium nitrate are as the carbon source and the nitrogen source and pH is 7.5 to improve the ability to produce amylase.

Amylase; Medium; Culture conditions

紀(jì)韋韋(1981- )，男，江蘇句容人，講師，從事食品加工與質(zhì)量控制研究。

2016-07-22

Q 556+.2

A

0517-6611(2016)28-0003-04