益肺湯對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株移植瘤裸鼠P-gp基因表達(dá)和免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

凌仕良，欒智宇，張小玲，山廣志，劉帆

寧波市中醫(yī)院，浙江 寧波 315000

益肺湯對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株移植瘤裸鼠P-gp基因表達(dá)和免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

凌仕良，欒智宇，張小玲，山廣志，劉帆

寧波市中醫(yī)院，浙江 寧波 315000

目的：通過(guò)觀察益肺湯對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株（A549/DDP）移植瘤裸鼠脾臟指數(shù)和肺癌多藥耐藥P-糖蛋白（P-gp）基因表達(dá)的影響，探討益肺湯對(duì)裸鼠免疫功能的影響和逆轉(zhuǎn)肺癌多藥耐藥的作用機(jī)制。方法：建立A549/DDP裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、益肺湯低劑量組、益肺湯中劑量組、益肺湯高劑量組、益肺湯中劑量+順鉑組，共6組，每組10只，分別給與相應(yīng)的藥物干預(yù)。給藥21天后，處死小鼠取瘤組織和脾臟，稱脾重，計(jì)算各組脾臟指數(shù)；檢測(cè)瘤組織基因P-gp的表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，順鉑組的脾臟指數(shù)顯著降低，益肺湯中、高劑量組的脾臟指數(shù)有所提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與順鉑組比較，益肺湯低、中、高各劑量組及益肺湯中劑量+順鉑組的脾臟指數(shù)均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。益肺湯低、中、高各劑量組及益肺湯中劑量+順鉑組的P-gp基因的表達(dá)量均低于對(duì)照組，而順鉑組的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：益肺湯能提高裸鼠的免疫功能，逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制是通過(guò)下調(diào)多藥耐藥基因P-gp的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

益肺湯；逆轉(zhuǎn)多藥耐藥；脾臟指數(shù)；P-糖蛋白（P-gp）基因；人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株（A549/DDP）；裸鼠；細(xì)胞培養(yǎng)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

近50年來(lái)，肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅很大的惡性腫瘤之一。根據(jù)我國(guó)20世紀(jì)80年代末以來(lái)的10余年的抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，肺癌的發(fā)病率逐年遞增，年均增長(zhǎng)率達(dá)到1.6%，目前在我國(guó)所有惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率的排名中，肺癌已居首位[1～2]。肺癌主要分為兩類(lèi)，小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，而NSCLC約占所有肺癌的85%左右[3]。化療是NSCLC(尤其是中晚期患者)的主要治療方法之一，雖然新的化療藥物以及新的化療方案層出不窮，但目前現(xiàn)有的化療藥物臨床治療效果并不理想，臨床治愈率和五年生存率仍然比較低，其中多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是化療失敗的主要原因之一[4]。開(kāi)發(fā)高效安全的MDR逆轉(zhuǎn)劑已成為當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，充分發(fā)揮中醫(yī)藥資源豐富、多靶點(diǎn)作用，針對(duì)MDR復(fù)雜的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株(A549/DDP)的裸鼠移植瘤模型，觀察益肺湯對(duì)裸鼠脾指數(shù)及肺癌多藥耐藥基因P-糖蛋白(P-gp)基因表達(dá)的影響，探討益肺湯對(duì)裸鼠免疫功能的影響和逆轉(zhuǎn)NSCLC多藥耐藥的作用機(jī)制，并為臨床運(yùn)用此方提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與動(dòng)物人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞(浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)；BALB/c-nu/nu裸鼠80只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬) 2013-0016)，5～6周齡，雌性，在水平式空氣層流凈化室內(nèi)(SPF級(jí))繁殖飼養(yǎng)，室溫保持25±2℃，相對(duì)濕度40%～60%，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助飼養(yǎng)。

1.2主要藥物及試劑益肺湯組成：紅豆杉8 g，白術(shù)、半夏各15 g，茯苓、黨參各20 g，陳皮、甘草各6 g，所有中藥由寧波市中醫(yī)院中藥制劑室提供并制備相應(yīng)濃度湯液。順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)；臺(tái)盼藍(lán)(上?；瘜W(xué)試劑總廠)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)A549/DDP細(xì)胞以高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.4建立移植瘤模型參考文獻(xiàn)[5]。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶分解消化，用PBS磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入生理鹽水重新懸置細(xì)胞，再以臺(tái)盼蘭染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞率，確保活細(xì)胞率大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/mL，細(xì)胞懸液放置于冰上，將此細(xì)胞懸液接種于BALB/c-nu/nu裸鼠的頸背部皮下，每只接種0.2 mL細(xì)胞懸液造模。整個(gè)操作在SPF級(jí)條件下進(jìn)行，接種過(guò)程在細(xì)胞懸液制備后1 h內(nèi)完成。

1.5分組及給藥將造模成功的60只裸鼠編號(hào)，用隨機(jī)區(qū)組分組法分為對(duì)照組、順鉑組、益肺湯低劑量組、益肺湯中劑量組、益肺湯高劑量組、益肺湯中劑量+順鉑組，共6組，每組10只，各組間小鼠體重及瘤體積無(wú)顯著性差異。然后按如下方法開(kāi)始分組給藥：①對(duì)照組：生理鹽水灌胃0.4 mL/(次·天)；②順鉑組：將順鉑注射液配制成0.1 mg/mL的稀釋液，按2 mg/kg給藥，腹腔注射順鉑稀釋液0.4 mL/次，隔天1次；③益肺湯低、中、高各劑量組：中藥浸泡1.5 h左右，煎煮2次，合并煎液，再濃縮使低、中、高各劑量組的生藥含量分別為0.7 g/mL、1.4 g/mL、2.8 g/mL，分別灌胃0.4 mL/(次·天)；④益肺湯中劑量+順鉑組：中劑量濃度益肺湯煎劑灌胃0.4 mL/(次·天)，同時(shí)腹腔注射順鉑稀釋液0.4 mL/次，隔天1次。共給藥21天。

1.6脾臟指數(shù)的測(cè)定給藥21天后，稱量小鼠體重后脫頸法處死所有小鼠，解剖并取出脾臟，稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)(%)[6]=脾重(mg)/體重(g)×100%。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P-gp基因的表達(dá)提取瘤組織總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)目的基因P-gp的表達(dá)。目的基因P-gp的引物序列為：上游引物：F5'-CAGCAGTCAGTGTGCTTA CAA-3'，下游引物：R5'-ATGGCTCTTTTATCGGCCTCA-3'。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)構(gòu)建反應(yīng)體系，檢測(cè)P-gp基因的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用(±s)表示，采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)差異，并用LSD檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各組脾臟指數(shù)結(jié)果比較見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，順鉑組的脾臟指數(shù)顯著降低，益肺湯中、高劑量組的脾臟指數(shù)有所提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與順鉑組比較，益肺湯低、中、高劑量組及益肺湯中劑量+順鉑組的脾臟指數(shù)均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1　各組脾臟指數(shù)結(jié)果比較(±s)

表1　各組脾臟指數(shù)結(jié)果比較(±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與順鉑組比較，②P＜0.05

組別對(duì)照組順鉑組益肺湯低劑量組益肺湯中劑量組益肺湯高劑量組益肺湯中劑量+順鉑組樣本數(shù)(n) 10 10 10 10 10 10脾臟指數(shù)(%) 10.03±3.25 6.43±2.10①11.59±2.64②15.58±2.73①②13.13±2.14①②9.42±2.14②

2.2各組P-gp基因表達(dá)結(jié)果比較見(jiàn)表2。益肺湯低、中、高各劑量組及益肺湯中劑量+順鉑組的P-gp基因的表達(dá)量均低于對(duì)照組，而順鉑組的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2　各組P-gp基因表達(dá)結(jié)果比較(±s)

表2　各組P-gp基因表達(dá)結(jié)果比較(±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別對(duì)照組順鉑組益肺湯低劑量組益肺湯中劑量組益肺湯高劑量組益肺湯中劑量+順鉑組樣本數(shù)(n) 10 10 10 10 10 10 P-gp基因表達(dá)量0.0159±0.00166 0.0199±0.00419②0.0129±0.00157①0.0098±0.00312②0.0105±0.00146②0.0105±0.00146②

3　討論

中醫(yī)學(xué)的痰有狹義和廣義之分，狹義的痰指咳嗽咯出的痰液(外痰)，廣義的痰還包括體內(nèi)無(wú)形之痰(內(nèi)痰)。內(nèi)痰是腫瘤致病及其進(jìn)展的因素之一，具有易聚性(黏滯易阻塞成塊，形成臨床腫瘤病灶)、易行性(痰隨氣血無(wú)處不到，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移浸潤(rùn))、頑固性(痰邪陰柔，病勢(shì)纏綿，不易速去，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象)等病理特點(diǎn)[7]。益肺湯正是基于“頑病多痰”的學(xué)術(shù)思想，根據(jù)肺癌正氣內(nèi)虛、痰瘀交結(jié)的病機(jī)特點(diǎn)，參考現(xiàn)代藥理研究總結(jié)出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期的臨床經(jīng)驗(yàn)表明[8～9]，該方對(duì)非小細(xì)胞肺癌化療的耐藥逆轉(zhuǎn)具有一定的療效。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與免疫功能有著密切的關(guān)系，并且機(jī)體免疫功能的狀況對(duì)腫瘤治療的效果和預(yù)后評(píng)估也有參考價(jià)值[10～11]。因BALB/c-nu/nu裸鼠沒(méi)有胸腺，所以造成其T細(xì)胞免疫缺陷，可提高移植瘤造模的成功率。BALB/c-nu/nu裸鼠有脾臟，故其有一定的體液免疫功能，其免疫功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)可用脾指數(shù)來(lái)反映。與對(duì)照組比較，順鉑組的脾臟指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，益肺湯中、高劑量組的脾臟指數(shù)有所提高(P＜0.05)，其中益肺湯中劑量組為最高；與順鉑組比較，益肺湯低、中、高各劑量組及益肺湯中劑量+順鉑組的脾臟指數(shù)均顯著提高(P＜0.05)。這說(shuō)明順鉑對(duì)裸鼠的免疫功能具有抑制作用，益肺湯能保護(hù)裸鼠的免疫器官，提高裸鼠的免疫功能。

P-糖蛋白是由多藥耐藥基因(Multidrug Resistance Gene，MDR)編碼的跨膜糖蛋白，其相對(duì)分子量為170 KD，具有能量依賴性“藥泵”功能[12]。P-糖蛋白屬于ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，能利用ATP水解所釋放出的能量將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物逆濃度梯度泵至細(xì)胞外，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物達(dá)不到最低有效作用濃度而使化療失敗，它們不但能使腫瘤細(xì)胞對(duì)某一兩種化療藥物產(chǎn)生抗藥性，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制也不同的藥物也產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生[13]。與對(duì)照組比較，益肺湯低、中、高劑量組及聯(lián)合組的P-gp基因的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，其中以益肺湯高劑量組為最；而順鉑組P-gp基因的表達(dá)量有所提高(P＜0.05)。這說(shuō)明益肺湯對(duì)A549/DDP移植瘤細(xì)胞的P-gp基因的表達(dá)產(chǎn)生了抑制作用，而順鉑卻刺激了二者的高表達(dá)。通過(guò)綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，益肺湯可以提高裸鼠的免疫功能，能逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌的多藥耐藥，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制是通過(guò)下調(diào)P-gp基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Experiment Study of Yifei Tang on Expression of P-gp Genes and Immune Function of Nude Rats with Human Lung Adenocarcinoma Cisplatin Cell Line Transplantation Tumor

LING Shiliang，LUAN Zhiyu，ZHANG Xiaoling，SHAN Guangzhi，LIU Fan

Objective：To observe the effect of Yifei tang on the spleen index and expression of lung cancer multidrug resistance P-glycoprotein(P-gp)genes of nude rats with human lung adenocarcinoma cell line(A549/DDP)transplantation tumor，and to discuss preliminarily the effect of Yifei tang on the immune function of nude rats and the mechanism of reversing lung cancer multidrug resistance.Methods：Established A549/DDP nude rats model of transplantation tumor，and divided them into the control group，cisplatin group，Yifei tang low dosage group，Yifei tang middle dosage group，Yifei tang high dosage group and Yifei tang middle dosage combined with cisplatin group randomly，six groups in total and 10 cases in each group.Each group was given corresponding medicine respectively.After 21 days，the rats were sacrificed，and the tissues and spleens were weighed to calculate the spleen index of each group.Detected the expression of cancer tissue P-gp genes.Results：Compared with control group，the spleen index of cisplatin group was reduced significantly，that of Yifei tang high dosage group was increased，there being significant difference(P＜0.05).The spleen index of Yifei tang low，middle and high dosage groups as well as Yifei tang middle dosage combined with cisplatin group，comparing with that of cisplatin group，were all increased obviously(P＜0.05).The expression levels of P-gp genes in Yifei tang low，middle and high dosage groups and Yifei Tang middle dosage combined with cisplatin group were lower than those of the control group，while the expression levels of cisplatin group was higher than those of the control group(P＜0.05).Conclusion：Yifei tang can improve the immune function of nude rats and reverse non-small cell lung cancer multidrug resistance.The reversing mechanism is achieved by down-regulating the expression of multidrug resistance P-gp genes.

Yifei tang；Multidrug resistance；Spleen index；P-glycoprotein(P-gp)genes；Human lung adenocarcinoma cell line(A549/DDP)；Nude mouse；Cell culture；Animal experiment

R285

A

0256-7415（2016）11-0215-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.11.092

2016-05-06

寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010A11）

凌仕良（1983-），男，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤疾病研究。