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    全氟辛烷磺酸(PFOA)對斜生柵藻的毒性效應(yīng)研究

    2016-11-24 07:04:16蔣美卿許曉路張德勇
    資源節(jié)約與環(huán)保 2016年6期
    關(guān)鍵詞:斜生酶類柵藻

    蔣美卿 許曉路 張德勇

    (1浙江金象科技有限公司浙江東陽3221002浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院浙江杭州310015)

    全氟辛烷磺酸(PFOA)對斜生柵藻的毒性效應(yīng)研究

    蔣美卿1許曉路2*張德勇2

    (1浙江金象科技有限公司浙江東陽3221002浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院浙江杭州310015)

    為了分析全氟辛烷磺酸(PFOA)對淡水生態(tài)系統(tǒng)的危害,選擇斜生柵藻為受試對象。首先設(shè)計(jì)了急性毒性試驗(yàn),計(jì)算出PFOA對斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。然后將斜生柵藻在含有不同濃度PFOA的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)8天,測定葉綠素、抗氧化酶、丙二醛等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示,斜生柵藻的葉綠素含量在PFOA達(dá)到50mg/L劑量時(shí)開始表現(xiàn)出降低,抗氧化酶類的活性在PFOA達(dá)到50mg/L或100mg/L劑量時(shí)表現(xiàn)出降低,MDA含量在PFOA達(dá)到150mg/L劑量時(shí)開始表現(xiàn)為上升。研究結(jié)果顯示PFOA在高濃度下會(huì)影響藻類的光合作用及多種代謝活動(dòng)。

    PFOA;斜生柵藻;葉綠素;抗氧化酶;丙二醛

    全氟辛烷磺酸(PFOA)分子式為C8F17SO3,它由全氟化酸性硫酸基酸中完全氟化的陰離子組成。PFOA是一種持久性有機(jī)污染物,具有難以降解、易于經(jīng)食物鏈在各級生物體內(nèi)蓄積等特點(diǎn)。PFOA分子中的碳氟鍵高度穩(wěn)定,水解、光解、生物降解等手段均難以對其發(fā)揮降解作用[1]。半個(gè)多世紀(jì)以來,PFOA作為表面保護(hù)劑廣泛應(yīng)用于毛毯、皮革、紙張、包裝材料、纖維等產(chǎn)品,或作為表面活性劑應(yīng)用于起泡劑、酸霧抑制劑、堿性清潔劑、地板拋光劑、感光膠片、義齒清潔劑、洗發(fā)水等[2]。目前在全球大多數(shù)水系中均能檢測到PFOA的污染,其潛在的生態(tài)威脅受到高度關(guān)注。包括歐盟國家、美國等在內(nèi)的許多國家已經(jīng)采取措施限制相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用。

    已有的研究顯示,PFOA對魚類、禽類、大鼠等動(dòng)物具有多種毒性,涉及生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、腎臟毒性等,但在藻類上的研究報(bào)道尚且不多見,相關(guān)研究尚不夠系統(tǒng)和深入[3]。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中初級生產(chǎn)者,對整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和生態(tài)平衡至關(guān)重要。有些藻類甚至被作為水質(zhì)評價(jià)的指標(biāo),因?yàn)樗鼈兺趦艋w富營養(yǎng)化中起到重要作用,對環(huán)境變化反應(yīng)敏感[4]。斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)是一種常見的淡水綠藻,易于在營養(yǎng)豐富的水體中繁殖,是一種常用的水質(zhì)評價(jià)指示生物。由于斜生柵藻易于人工培養(yǎng),也經(jīng)常用于生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域。本研究主要擬研究水中的PFOA對斜生柵藻的繁殖及一些關(guān)鍵的生化指標(biāo)有何影響,以初步揭示其對水生生態(tài)系統(tǒng)的潛在毒性。

    1 材料與方法

    1.1材料

    斜生柵藻由中科院水生生物研究所提供;PFOA購自百靈威公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑由浙江樹人大學(xué)生態(tài)與環(huán)境保護(hù)研究所提供。

    1.2藻類培養(yǎng)與染毒方案

    斜生柵藻接種于含不同濃度PFOA的HB-4培養(yǎng)基,于250mL的錐形瓶進(jìn)行培養(yǎng),起始濃度為7×105個(gè)/mL[5]。急性毒性實(shí)驗(yàn)中PFOA濃度為80mg/L~600 mg/L,慢性毒性實(shí)驗(yàn)中為20 to 250 mg/L。藻類培養(yǎng)過程中用4層紗布封口,于24℃、光照黑暗循環(huán)(12h/12h)條件培養(yǎng)8天,每天搖動(dòng)5次。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每天取樣分析增殖速度,實(shí)驗(yàn)結(jié)束(8天)后測定葉綠素含量、抗氧化酶系、MDA等。

    1.396h-EC50計(jì)算

    藻類的生物量用光密度法進(jìn)行快速測定,基于前期研究中建立的公式“y=0.0134x+0.036”進(jìn)行藻類細(xì)胞密度換算。式中y為A690值,x為細(xì)胞數(shù)量(*106個(gè)/mL)。分別計(jì)算出不同濃度PFOA染毒96h后,對藻類生長的抑制率,利用Jiang等報(bào)道的方法,計(jì)算96h-EC50值[6]。

    1.4葉綠素含量分析

    取30mL藻液用0.45μm濾膜過濾截留藻細(xì)胞,將其帶濾膜剪碎移入研缽,加入少量乙醇研磨,離心后濾液定容到10 mL,于4℃黑暗環(huán)境中提取4 h。提取液3000rpm離心20 min,取上清,移入10mL比色管。用90%乙醇定容至10 mL。取上清液于比色皿中,以90%乙醇溶液作參比,于分光光度計(jì)上提取液的A665和A649值。葉綠素a濃度(mg/L)=13.95A665-6.88A649;葉綠素b濃度(mg/L)=24.96A649-7.32A665。二者之和為葉綠素濃度。

    1.5抗氧化酶系的活力分析

    取30mL藻液,4000g離心15 min,沉淀用pH7.8的PBS重懸,進(jìn)行超聲破碎。10000g離心10 min,上清作為粗酶液,分別測定過氧化氫酶(CAT)、超氧化歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活力。CAT的測定,反應(yīng)體系中加6 mL0.05 mol/LPBS(pH7.0)、0.4 mL 0.3%H2O2,、0.1 mL粗酶液。每分鐘使A240值升高0.01的酶活力定義為1個(gè)CAT酶活單位[7]。SOD活性分析采用Chen等報(bào)道的方法,能抑制該反應(yīng)體系每分鐘ΔA560值達(dá)50%抑制率的酶活力定義為1個(gè)酶活單位[7]。POD活力的測定參照Bewley等報(bào)道的方法,使該反應(yīng)體系每分鐘A470變化值達(dá)0.01的酶活力定義為1個(gè)單位[8]。單位質(zhì)量藻樣中的酶活力=總酶活/樣品總重。

    1.6丙二醛(MDA)含量分析

    30mL藻液經(jīng)濾膜濃縮后,加入10%TCA,直接研磨破碎藻細(xì)胞,勻漿經(jīng)10000g離心10min,上清液為丙二醛提取液。吸取2 mL提取液于試管中,加入0.6%硫代巴比妥酸2 mL,于沸水浴上加熱10min,迅速冷卻。于4000 g離心10min,取上清,測A450、A532、A600值。MDA的濃度=6.45(A532-A600)-0.56*A450[9]。

    1.7統(tǒng)計(jì)分析

    利用SPSS軟件(V11.5),采用One-wayANOVA方法分析不同實(shí)驗(yàn)組結(jié)果之間的差異顯著性。

    2 結(jié)果

    2.196h-EC50值

    抑制率(P%)和濃度的自然對數(shù)(LnC)的線性回歸方程:y=0. 2968x-0.9164,R2=0.9964。經(jīng)計(jì)算,PFOA對斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。

    2.2葉綠素及MDA含量

    表1所示,當(dāng)PFOA劑量大于或等于50 mg/L時(shí),引起斜生柵藻中葉綠素a的含量降低(p<0.05);當(dāng)PFOA劑量大于或等于100 mg/L時(shí),引起斜生柵藻中葉綠素b的含量及總?cè)~綠素含量降低(p<0.05);當(dāng)PFOA劑量大于或等于150 mg/L時(shí),引起斜生柵藻中MDA含量升高(p<0.05)。這些結(jié)果顯示PFOA會(huì)影響斜生柵藻中的葉綠素含量與MDA含量。

    表1 各處理組的葉綠素含量及MDA含量

    2.3抗氧化酶的活性

    如表2所示,當(dāng)PFOA劑量大于或等于50 mg/L時(shí),引起斜生柵藻中SOD活力降低(p<0.05);當(dāng)PFOA劑量大于或等于100 mg/L時(shí),引起斜生柵藻中CAT活力與POD活力降低(p<0.05)。

    表2 各處理組的三種抗氧化酶類的活性

    3 討論

    在世界各地的水系中普遍檢測到PFOA污染,而關(guān)于其對水生生態(tài)系統(tǒng)的危害研究報(bào)道尚較少。本研究PFOA對斜生柵藻具有毒性效應(yīng),能抑制藻類的增殖,并就算出其96h-EC50值139.23 mg/L。八天的染毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),這種PFOA暴露會(huì)引起斜生柵藻的葉綠素含量下降、MDA含量上升及抗氧化酶類的活性降低。這種效應(yīng)大多于PFOA劑量達(dá)到50mg/L時(shí)開始表現(xiàn)出來。當(dāng)PFOA劑量達(dá)到250 mg/L時(shí),葉綠素a含量降低了約77%,葉綠素b含量降低了約45%,MDA濃度升高了約53%,CAT活力降低了約80%,POD活力降低了約74%,SOD活力降低了約77%,反映了高濃度的PFOA對藻類的生理活動(dòng)影響非常明顯。

    本研究主要分析了藻類的葉綠素、抗氧化酶類活性、MDA含量幾個(gè)重要的指標(biāo)。葉綠素是藻類進(jìn)行光合作用的基本依賴條件,其含量多少直接反映了藻類代謝和增殖活力的強(qiáng)弱。本研究中當(dāng)PFOA劑量達(dá)到100 mg/L時(shí),不管葉綠素a還是葉綠素b均開始表現(xiàn)出含量下降(p<0.05),反映了PFOA對藻類的光合作用有影響,且與劑量有關(guān)??寡趸割愅ㄟ^清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過多的活性氧可以幫助藻類保持氧代謝平衡,保護(hù)細(xì)胞膜免受膜脂過氧化損傷,從而維持細(xì)胞的完好性。在本研究中,低劑量的PFOA(低于50 mg/L)雖然引起了抗氧化酶類的活性平均水平稍低,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,這種抑制作用從PFOA劑量達(dá)到50 mg/L時(shí)開始逐步顯現(xiàn),并與劑量表現(xiàn)出正相關(guān)。MDA含量是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量可反映植物遭受逆境傷害的程度,作為一種抗逆性分子,它在植物處于脅迫環(huán)境中時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生,本研究中MDA濃度在PFOA劑量達(dá)到150mg/L時(shí)開始顯著升高(p<0. 05),顯示在高濃度PFOA環(huán)境中,藻類會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過氧化,也就意味著細(xì)胞的損傷。

    4 結(jié)語

    本研究證實(shí)了高濃度的PFOA對水體中的藻類有多方面的毒性作用,會(huì)對藻類的光合作用、抗氧化酶類的活力、膜脂完好性等有損害,說明PFOA大量排放會(huì)對淡水生態(tài)環(huán)境造成威脅,應(yīng)引起重視。

    [1]Giesy,J.P.&Kannan,K.2002.Perfluorochemical surfactants in the environment.Environ Sci Technol,Vol.36,p.146A-152A.

    [2]Giesy,J.P.&Kannan,K..2001.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife.Environ Sci Technol,Vol.35,p.1339-1342.

    [3]Lau,C.,Anitole,K.,Hodes,C.,et al.2007.Perfluoroalkyl acids:a reviewofmonitoring and toxicological findings.Toxicol Sci.,Vol.99-2, p.366-394.

    [4]Li,L.J.2007.Studies on Effects of Vanadate and Vanadium Complex on Growth and Physiology of Two Marine Microalgae,publications/Ocean UniversityofChina,Qingdao,p.11.

    [5]Shen,Y.F.&Zhang,Z.S.1990.Modern biomonitoring techniques using fresh water microbiota.Publications/China Archiurf&Building Press,Beijing,p.275-286.

    [6]Jiang,Y.L.,Lu,S.Z.&Shen,D.L.1996.Cellular biological experiment.publications/Fudan UniversityPress,Shanghai,p.16-17.

    [7]Chen K.,Zhu,T.,Zhang,Y.T,et al.2009.Effect ofnitric oxide on N metabolism and Thylakoid membrane in Chlorella pyrenodosa response to UV-B radiation,Ecology and Environmental Sciences,Vol.18,p. 865-868.

    [8]Bewley,T.D.1979.Physiological aspects of desiccation tolerance. Ann RevPlant Physiol.Vol.30,p.195-238.

    [9]Srivastava,O.P.&Huystee,V.P.B.1973.Evidence for close association of POD polyphenol oxidase and IAA oxidase isoenzyme of peanut suspension culture medium.Can J Bot,Vol.51,p.2207-2215.

    蔣美卿(1974—),女,浙江東陽人,本科,工程師,主要從事工程設(shè)計(jì)、環(huán)境保護(hù)等方面的研究。

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