阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)鈉-鈣交換體改善心力衰竭大鼠心臟功能*

王 姝， 王 瑞， 蔣雅楠， 王嵐峰， 潘 薇， 田 野△

(1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科， 2黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校， 3哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，黑龍江 哈爾濱 150006)

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阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)鈉-鈣交換體改善心力衰竭大鼠心臟功能*

王 姝1， 王 瑞2， 蔣雅楠3， 王嵐峰1， 潘 薇1， 田 野1△

(1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，2黑龍江護(hù)理高等專科學(xué)校，3哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，黑龍江 哈爾濱 150006)

目的： 探討阿托伐他汀對心力衰竭大鼠心臟功能及心肌細(xì)胞鈉-鈣交換體表達(dá)的影響。方法: 結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支 8 周，制備心肌梗死后心力衰竭模型。隨機(jī)分 3 組，即假手術(shù)組、心力衰竭組與阿托伐他汀治療組，分別于結(jié)扎后第2天給予安慰劑或阿托伐他汀治療。8周后測定大鼠心臟功能及鈉-鈣交換體蛋白表達(dá)水平。培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，通過缺氧模型分析阿托伐他汀對細(xì)胞內(nèi)鈣水平的影響。結(jié)果: 阿托伐他汀治療組較心衰組BNP水平降低，左室舒張末內(nèi)徑縮小，左室短軸縮短率升高。阿托伐他汀治療明顯降低心力衰竭時鈉-鈣交換體蛋白表達(dá)量，抑制缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣水平增加。結(jié)論: 阿托伐他汀治療改善心功能，可能與影響心力衰竭心肌細(xì)胞鈉-鈣交換體的表達(dá)及功能有關(guān)。

鈉-鈣交換體； 心力衰竭； 阿托伐他汀

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-me-thylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)還原酶是膽固醇體內(nèi)合成過程早期的限速酶，他汀類藥物即HMG-CoA還原酶的抑制劑，可以阻斷HMG-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸，從而顯著減少膽固醇的合成。已證實(shí)他汀類藥物能夠延緩冠心病進(jìn)展，降低冠心病患者的死亡率。近年來多項(xiàng)基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物的療效不完全與降脂作用有關(guān)，還有許多非降脂作用，包括改善內(nèi)皮功能、抑制細(xì)胞吸附和免疫調(diào)節(jié)作用、穩(wěn)定斑塊以及抗血小板作用等等。2013年Taylor等[1]研究指出他汀類藥物可以降低沒有冠心病證據(jù)人群的全因死亡率，降低主要血管事件及再血管化發(fā)生率，同時并不伴有明顯副作用。文獻(xiàn)報(bào)道他汀類藥能抑制心肌細(xì)胞肥大，降低心肌纖維化水平[2]，提示他汀類藥物可能對于心力衰竭具有一定的治療及保護(hù)作用。一部分文獻(xiàn)報(bào)道他汀類藥物可以改善心臟功能、降低心力衰竭病死率；另一部分文獻(xiàn)則指出他汀類藥物治療并未降低全因死亡率，他汀類藥物對于心力衰竭的影響存在較大爭議[3]。鈉-鈣交換體(sodium-calcium exchanger，NCX)是心肌細(xì)胞細(xì)胞膜上的一種陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要功能為舒張期 Ca2+的外運(yùn)，能夠?qū)⒓?xì)胞外 3 個 Na+轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)并同時將細(xì)胞內(nèi)1個 Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，當(dāng)細(xì)胞膜內(nèi)外 Na+/Ca2+的跨膜化學(xué)濃度階差出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)時，NCX可以同樣比例逆向轉(zhuǎn)運(yùn) Na+/Ca2+，其功能改變將導(dǎo)致心肌舒縮功能的紊亂，參與心肌缺血、心律失常、心力衰竭發(fā)生[4]。本文旨在研究缺血性心力衰竭發(fā)生時，阿托伐他汀的治療是否改善心功能、影響NCX的表達(dá)。

材 料 和 方 法

1 大鼠心力衰竭模型的復(fù)制及分組

雄性Wistar 大鼠，體重200～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物隨機(jī)分為 3 組：假手術(shù)組、心力衰竭組和阿托伐他汀治療組，每組15只。通過在大鼠左心耳和肺動脈圓錐之間大約齊左心耳下緣處結(jié)扎左冠狀動脈，建立心肌梗死后心力衰竭動物模型，假手術(shù)組為只穿線不結(jié)扎。阿托伐他汀治療組，結(jié)扎左冠狀動脈后第2天通過灌胃的方法，每天給予阿托伐他汀(10 mg/kg，用 1%纖維素鈉混勻)；心力衰竭組和假結(jié)扎對照組則用纖維素鈉替代。喂養(yǎng) 8周后測定心臟超聲，并取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超聲心動圖測定 應(yīng)用BL-420E 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。治療后第8周給予超聲心動圖檢查。以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠置于檢查臺上，利用 10 MHz 高頻率探頭，從胸骨旁長軸切面進(jìn)行測量。

2.2 Western blot法測定蛋白水平 取心肌標(biāo)本100 mg置玻璃勻裝器中，加入裂解緩沖液，冰上碾磨，置離心管中于4 °C低溫離心機(jī)以14 000 r/min離心15 min，取上清液分裝保存于-80 °C低溫冰箱。Bradford比色法測定蛋白濃度。膜蛋白以SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到NC膜(Millipore)上。轉(zhuǎn)移后，5%脫脂奶粉4 °C封閉過夜，后繼續(xù)與各抗體 I 抗室溫下孵育，最后孵育 II 抗，洗脫后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR Bioscience)成像，實(shí)驗(yàn)過程以GAPDH作為內(nèi)參照。蛋白條帶應(yīng)用Odyssey Software 3.0軟件分析并用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。檢測腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)、NCX和GAPDH在各個對照組和模型組中表達(dá)量的變化。Western blot條帶的灰度值通過Odyssey 3.0軟件分析。

2.3 原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)Wis-tar大鼠，斷頭取下心臟，0.25%胰蛋白酶消化, 分離成單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液，離心后混懸于含 10% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中， 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h，去除貼壁的非心肌細(xì)胞，調(diào)整心肌細(xì)胞濃度，接種于預(yù)置了蓋玻片的 6 孔培養(yǎng)板中，每 24 h 更換培養(yǎng)液, 前 3 d 加用0.1 mmol/ L溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)，抑制非心肌細(xì)胞生長，培養(yǎng)液加入青、鏈霉素(均為 1×105U/L)預(yù)防細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)干預(yù)前 24 h 更換無血清 DMEM 培養(yǎng)液，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。放入缺氧孵箱2 h。

2.4 共聚焦顯微成像測定細(xì)胞內(nèi)鈣 在激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm，物鏡(×20)下實(shí)時監(jiān)測[Ca2+]i的變化。在Time series程序下對細(xì)胞XY平面進(jìn)行掃描，間隔時間為10 s，共掃描30次，計(jì)算細(xì)胞XY平面內(nèi)平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)，以MFI代表[Ca2+]i。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。當(dāng)資料符合參數(shù)檢驗(yàn)條件時，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不符合參數(shù)檢驗(yàn)條件時，采用非參數(shù)Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)并使用Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 阿托伐他汀對心力衰竭大鼠心功能的影響

前降支結(jié)扎8周后，心衰組大鼠體重下降、運(yùn)動減少、食量下降；阿托伐他汀組大鼠則表現(xiàn)出良好的食欲及活動狀態(tài)。與假手術(shù)組相比，心力衰竭對照組死亡率增加，阿托伐他汀治療降低心衰大鼠死亡率。取材后測量心臟重量和體重。結(jié)果表明，心衰大鼠心臟重量與體重之比明顯增加，大于假手術(shù)組,而心率在各組之間沒有明顯變化。如病理切片所示，與對照組相比，心衰組大量炎癥細(xì)胞浸潤，而阿托伐他汀治療組炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，見圖1。通過超聲心動圖評價(jià)心臟的功能，發(fā)現(xiàn)心力衰竭組左室舒張末徑(left ventricular diastolic dimension，LVDD)大于假手術(shù)組，阿托伐他汀治療后，左室舒張末徑小于心衰組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心力衰竭組左心室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)為(28.6±3.84)%，低于假手術(shù)組，阿托伐他汀治療組的射血分?jǐn)?shù)為(35.3±3.89)%，高于心衰組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Heart-body weight ratio and heart rate in each group, and pathological changes of the myocardium (HE staining, ×200). A: heart/body weight ratio; B: heart rate; C: heart tissue sections with HE staining. CTRL: control group; HF: heart failure group; AT: atorvastatin group; BW: body weight; HW: heart weight. Mean±SD.*P<0．05vsCTRL group.

圖1 各組大鼠心臟體重比、心率和HE病理染色結(jié)果

Figure 2.Left ventricular diastolic dimension (LVDD) and fractional shortening (FS) in each group determined by echocardiolgraphy. A: FS in each group; B: LVDD in each group; C: the typical graph of echocardiolgraphy. CTRL: control group; HF: heart failure group; AT: atorvastatin group. Mean±SD.*P<0.05vsCTRL group;#P<0.05vsHF group.

圖2 超聲心動圖測定各組大鼠的FS及LVDD

2 阿托伐他汀對心力衰竭大鼠BNP及NCX蛋白表達(dá)水平的影響

通過Western blot法檢測心臟BNP蛋白的表達(dá)水平。BNP表達(dá)在心衰組增加，可被阿托伐他汀治療逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。有研究報(bào)道，在心衰大鼠的NCX蛋白水平較高[5]，我們的結(jié)果也表明，NCX蛋白水平高于對照組，阿托伐他汀治療組降低NCX表達(dá)水平(P<0.05),見圖3。

3 阿托伐他汀對缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的影響

通過放入缺氧孵箱孵化2 h制備心肌細(xì)胞缺氧模型，觀察靜息細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化，可見缺氧組明顯高于對照組(P<0.05)。這種增加的細(xì)胞內(nèi)鈣水平可以被阿托伐他汀和NCX抑制劑SEA0400所抑制，見圖 3。

Figure 3.The protein levels of BNP and NCX in the rats with different treatments, and intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) during hypoxemia. A: BNP protein level; B: NCX protein level; C: [Ca2+]iduring hypoxemia. CTRL: control group; HF: heart failure group; AT: atorvastatin group; BNP: brain natriuretic peptide; NCX: sodium calcium exchanger; NCX-I: sodium calcium exchanger inhibitor. Mean±SD.*P<0.05vsCTRL group;#P<0.05vsHF group.

圖3 各組大鼠的NCX、BNP蛋白水平及缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣水平變化

討 論

慢性心力衰竭是一種進(jìn)行性的心肌損害，其病理生理學(xué)機(jī)制是心肌細(xì)胞收縮、舒張功能的進(jìn)行性減退。缺血性心臟病是引起心力衰竭發(fā)生的重要原因。本文通過結(jié)扎大鼠冠脈前降支，制備梗死模型，經(jīng)過8周飼養(yǎng)成功制備梗死后心力衰竭模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠心臟功能降低、鈉-鈣交換體表達(dá)增加，而阿托伐他汀治療可部分逆轉(zhuǎn)上述變化；并進(jìn)一步通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明阿托伐他汀抑制缺氧相關(guān)性細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

他汀類藥物最開始被用于臨床降低血脂治療，隨著對他汀類藥物研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)除了具有調(diào)節(jié)血脂作用外，它還能夠抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣斑塊，改善血管內(nèi)皮功能。延緩動脈粥樣硬化程度、抗炎、保護(hù)神經(jīng)和抗血栓等作用，此外還有微小的降壓、減緩心肌纖維化、提高左室收縮功能的作用。觀察性研究、前瞻性研究和臨床隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)皆表明他汀類藥物尤其是阿托伐他汀可以降低心肌梗死后心力衰竭相關(guān)的全因死亡率及再住院率[6]。而歐洲科學(xué)家的一項(xiàng)研究顯示[7]，慢性心力衰竭患者服用他汀類藥物可以減少心源性猝死的危險(xiǎn)。研究人員選取了數(shù)百名比較嚴(yán)重的心衰患者進(jìn)行為期一年的跟蹤研究。其中一部分患者按時服用阿托伐他汀(他汀類藥物的一種)。另一部分患者服用安慰劑。結(jié)果在一年之內(nèi)，服藥組患者的心源性猝死率為5%，而對照組患者的心源性猝死率高達(dá)22%。我們的研究結(jié)果表明，他汀組大鼠的死亡率低于心衰組的死亡率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。BNP主要來源于心室，心室的體積和壓力增高可導(dǎo)致血漿內(nèi)BNP的升高，可以敏感和特異性地反映左心室功能的變化。他汀治療組BNP水平下降，提示他汀類藥物改善了心力衰竭大鼠的心臟功能。NCX 是可興奮細(xì)胞膜上一種重要的雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與維持心肌鈣穩(wěn)態(tài)。 NCX可以通過Ca2+激活動作電位延遲后去極化而引發(fā)心律失常[4, 8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道心肌肥厚或心力衰竭的NCX在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)可發(fā)生成倍的增加[10-11]。NCX表達(dá)增加是心力衰竭時心律失常、心臟猝死發(fā)生的可能原因之一。本研究結(jié)果也證明心力衰竭時NCX蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而他汀類藥物治療組NCX表達(dá)量明顯下調(diào)，提示他汀類藥物調(diào)節(jié)心力衰竭時NCX表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是缺血心肌在再灌注過程中細(xì)胞凋亡、壞死以及心功能降低的重要原因?，F(xiàn)在普遍接受NCX介導(dǎo)缺血/再灌注損傷引起Ca2+超載。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧條件下心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而阿托伐他汀及鈉-鈣交換體抑制劑可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of atorvastatin on progression of heart failure and association with sodium-calcium exchanger expression

WANG Shu1, WANG Rui2, JIANG Ya-nan3, WANG Lan-feng1, PAN Wei1, TIAN Ye1

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,2HeilongjiangNursingCollege,3DepartmentofPharmacology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150006,China.E-mail:yetian6@163.com)

AIM: To investigate the effect of atorvastatin on the development of heart failure after myocardial infarction and the association with sodium-calcium exchanger (NCX) expression.METHODS: The model of heart failure was established by ligation of the anterior descending coronary artery for 8 weeks. The rats were randomly divided into control group, heart failure group, and atorvastatin group. Either atorvastatin (10 mg·kg-1·d-1) or vehicle was orally administered to the rats on the next day after the surgery. The left ventricular function and NCX expression were analyzed 8 weeks after ligation. Neonatal rat cardiomyocytes were cultured to investigate the effect of atorvastatin on the changes of calcium concentration induced by hypoxemia.RESULTS: A decrease in left ventricular diastolic dimension, an increase in left ventricular fractional shortening, and reductions of BNP level and NCX expression were observed in atorvastatin group. The hypoxemia-induced calcium overload in cultured cardiomyocytes was inhibited by atorvastatin, and it was inhibited by the inhibitor of NCX.CONCLUSION: Atorvastatin treatment improves cardiac function, which may be related to the expression and function of sodium calcium exchanger in heart failure.

Sodium-calcium exchanger; Heart failure; Atorvastatin

1000- 4718(2016)10- 1900- 05

2016- 02- 17

2016- 08- 16

黑龍江省衛(wèi)生廳課題(No. 2007-161); 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院院基金資助項(xiàng)目(No. 2007090)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013M541443)

△通訊作者 Tel: 0451-85555707； E-mail: yetian6@163.com

R541； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.027

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