TGF-β1/Smad通路在血管緊張素Ⅱ下調(diào)縫隙連接蛋白43表達(dá)中的作用*

侯婧瑛， 周長(zhǎng)青， 鄭韶欣， 郭天柱， 龍會(huì)寶， 伍權(quán)華， 鐘婷婷， 王 彤△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1急診科， 2心內(nèi)科， 廣東 廣州 510120)

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TGF-β1/Smad通路在血管緊張素Ⅱ下調(diào)縫隙連接蛋白43表達(dá)中的作用*

侯婧瑛1， 周長(zhǎng)青1， 鄭韶欣2， 郭天柱1， 龍會(huì)寶1， 伍權(quán)華1， 鐘婷婷1， 王 彤1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1急診科，2心內(nèi)科， 廣東 廣州 510120)

目的： 分析心肌梗死(MI)后心臟組織中血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、縫隙連接蛋白43(Cx43)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad通路相關(guān)因子的變化情況，以探討Ang Ⅱ 能否經(jīng)由TGF-β1/Smad 調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)。方法: 采用左前降支冠狀動(dòng)脈 (LAD) 結(jié)扎建立大鼠心肌梗死模型后，20只SD雄性大鼠隨機(jī)分為氯沙坦(20 mg·kg-1·d-1)治療組與MI組，分別于結(jié)扎后及治療2周后檢測(cè)心功能情況，并檢測(cè)治療2周后左室心肌組織不同區(qū)域Ang Ⅱ、Ang Ⅱ 1型受體 (AT1)、Cx43以及TGF-β1/Smad通路相關(guān)分子的變化情況。結(jié)果: 氯沙坦組左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)明顯縮小(P<0.01)，室間隔厚度(IVSd)及左室后壁厚度(LVPWd)明顯減小(P<0.05)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)顯著增加(P<0.01)；梗死區(qū)和邊緣區(qū)的Ang Ⅱ水平明顯降低；梗死區(qū)AT1表達(dá)顯著降低；Cx43在心肌組織不同區(qū)域表達(dá)增高，TGF-β1、Smad 2、Smad 3在心肌組織不同區(qū)域表達(dá)均降低，而Smad 7表達(dá)增高。結(jié)論: 心肌梗死后Ang Ⅱ激活可能通過(guò)作用于TGF-β1/Smad通路導(dǎo)致Cx43表達(dá)下調(diào)。

血管緊張素Ⅱ； 縫隙連接蛋白43； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1； Smad； 心肌梗死

急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)及伴隨而來(lái)的心力衰竭是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的心血管疾病之一[1]?，F(xiàn)階段針對(duì)心肌梗死后心力衰竭的治療仍然是一個(gè)醫(yī)學(xué)難點(diǎn)。盡管采取了多種綜合防治措施，但心梗后心衰的病死率仍居高不下[2]，其根本原因在于相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚未闡明。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng) (renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 的過(guò)度激活在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位, RAAS 的過(guò)度激活加重了心肌損傷和心室重構(gòu)，并促進(jìn)了心衰的進(jìn)展，是影響預(yù)后和死亡的關(guān)鍵因素之一[3]。血管緊張素 Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 作為循環(huán)和局部RAAS的效應(yīng)分子, 在心肌和血管組織的病理性重構(gòu)過(guò)程中扮演重要角色。研究證實(shí),阻斷 Ang Ⅱ介導(dǎo)的效應(yīng)在心衰及心肌梗死后心功能不全的治療中有舉足輕重的作用，是改善心室重塑、心衰預(yù)后、降低死亡率的重要措施[4]。

惡性室性心律失常是急性心肌梗死和心力衰竭患者猝死的主要原因。心力衰竭時(shí)惡性室性心律失常的發(fā)生機(jī)制與心肌電重構(gòu)密切相關(guān)?？p隙連接蛋白43 (connexin 43, Cx43) 是心臟組織縫隙連接蛋白中的一種，對(duì)心臟功能的維持起重要作用[5]。近年來(lái)，Cx43對(duì)心肌電生理重構(gòu)的影響已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛重視[6-7]。目前有研究表明Ang Ⅱ與縫隙連接重構(gòu)之間存在關(guān)聯(lián)性[8]，盡管如此，心肌梗死后心力衰竭狀態(tài)下Ang Ⅱ?qū)x43 表達(dá)和分布的影響及具體調(diào)控機(jī)制卻鮮有研究報(bào)道。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforning growth factor-β1, TGF-β1)是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞因子，其不僅參與正常機(jī)體組織代謝和功能維持，在多種疾病病理生理過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用[9]。既往研究表明心肌梗死后Ang Ⅱ激活引起的心肌纖維化與TGF-β1密切相關(guān)，可見(jiàn)TGF-β1是Ang Ⅱ的重要下游信號(hào)分子[10]。新近研究表明TGF-β1與Cx43的重構(gòu)有關(guān)[11]。然而TGF-β1調(diào)節(jié)Cx43的具體通路仍未明確。在本研究中，我們通過(guò)分析心肌梗死后心臟組織中Ang Ⅱ、Cx43和TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子的變化情況，以探討Ang Ⅱ能否經(jīng)由TGF-β1/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠20只，體重(250±25) g，用于制備心肌梗死模型，上述動(dòng)物均由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。模型制備成功后，隨機(jī)分為2組，氯沙坦組和MI組，每組10只大鼠，均全部存活。

2 主要試劑及設(shè)備

血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 1, AT1)鼠單克隆抗體、 Cx43兔多克隆抗體、Smad 2/3兔多克隆抗體和Smad 7兔單克隆抗體(Abcam)；TGF-β1兔多克隆抗體 (Santa Cruz)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗 (Southern biotech)；Ang Ⅱ ELISA試劑盒(Ray Biotech)；Ⅱ抗及I抗稀釋液 (中杉金橋)；BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒(Abcam)； PVDF膜和發(fā)光液 (Millipore)； TRIzol RNA 提取試劑盒(Santa Cruz)；HX-300S型呼吸機(jī)(泰盟科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；心臟超聲分析儀(Philips)；定量PCR用SYBR Green 試劑(Invitrogen)；定量PCR儀ABI PRISM?7500(Invitrogen)。

3 方法

3.1 大鼠心肌梗死模型的制備及治療分組 6 月齡Sprague-Dawley大鼠麻醉后，氣管插管并接呼吸機(jī)，從左側(cè)第4肋間打開(kāi)胸腔，暴露心臟，用鑷子撕開(kāi)心包膜，清楚暴露左前降支冠狀動(dòng)脈，用帶5/0細(xì)尼龍絲線(xiàn)的小圓針縫扎左前降支冠狀動(dòng)脈。關(guān)胸前放置細(xì)塑料軟管，便于關(guān)胸后引流及吸取氣體和滲出的血液?？p扎成功的標(biāo)志是肢體心電圖ST 段明顯抬高，QRS 波寬大畸形，左室射血分?jǐn)?shù)顯著降低，具體見(jiàn)課題組前期文獻(xiàn)[12-13]。20只大鼠隨機(jī)分為氯沙坦治療組和MI組。氯沙坦組于心肌梗死模型建立后第1天起灌胃法給予氯沙坦20 mg·kg-1·d-1，MI組予以喂水(等量)處理，2組均治療2周。

3.2 心臟超聲檢測(cè) 所有大鼠心肌梗死模型成功制備及治療2周后檢測(cè)心功能。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(0.04 g/kg)麻醉，仰臥位四肢固定于木板上，使木板向左傾斜30°。剃凈胸毛，連接Ⅱ?qū)碾妶D。多普勒檢測(cè)頻率為3～12 MHz。探頭置于胸骨左側(cè)，顯示胸骨左室長(zhǎng)軸切面，探頭順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°顯示左室短軸切面。由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線(xiàn)并進(jìn)行測(cè)量。選擇清晰的圖像錄像待以后分析。檢測(cè)項(xiàng)目包括左室舒張末期內(nèi)徑 (left ventricular internal dimension at diastole, LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑 (left ventricular internal dimension at systole, LVIDs)、左室后壁厚度 (left ventricular posterior wall depth, LVPWd)、室間隔厚度(interventricular septal thickness, IVSd)和左室射血分?jǐn)?shù) (left ventricular ejection fraction, LVEF)，超聲檢測(cè)完成后，再處死大鼠進(jìn)一步做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

3.3 ELISA法檢測(cè) 處死大鼠后將摘取整個(gè)心臟，仔細(xì)分離梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、非梗死區(qū)的組織并迅速放置于-80 ℃的冰箱中保存。心肌 Ang Ⅱ濃度檢測(cè)采用ELISA 法，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.4 免疫熒光染色 心臟標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定24～36 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋連續(xù)切片(切片厚度3～5 μm)并固定到載玻片上；常規(guī)脫蠟水化；抗原修復(fù)以充分暴露抗原，提高抗原的檢測(cè)率；滴加10%正常山羊血清室溫下封閉30 min，用于吸附組織中的非特異性位點(diǎn)，以免造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性。滴加I抗(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加熒光標(biāo)記Ⅱ抗(1∶200)室溫濕盒避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；加入DAPI于室溫下濕盒避光孵育5 min；PBS洗1次，5 min；滴加抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下觀察心肌梗死區(qū)、邊緣區(qū)、非梗死區(qū)Cx43的表達(dá)情況并拍照。

3.5 Western blot檢測(cè) 用500 μL RIPA裂解液(含PMSF和Cocktail)裂解100 mg心臟各區(qū)域組織30 min，4 ℃下14 000 r/min離心10 min，取上清組織中總蛋白,于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法測(cè)定各樣品蛋白濃度，常規(guī)SDS-PAGE及蛋白電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h或4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相應(yīng)的I抗稀釋液4 ℃過(guò)夜或37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相應(yīng)Ⅱ抗稀釋液37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5 min，3次；蒸餾水漂洗膜2 min, 3次；將總體積為0.125 mL/cm2膜面積的發(fā)光液均勻地加到膜的表面，室溫孵育5 min，小心吸去膜表面多余的發(fā)光液，放至暗盒后顯影。

3.6 Real-time PCR檢測(cè) 用液氮研磨組織至粉末，加入1 mL TRIzol溶液提取總 RNA。并使用核酸蛋白分析儀和1.6%瓊脂糖電泳對(duì)所提取的總RNA 進(jìn)行分析。取總 RNA 液8 μL，70 ℃水浴5 min后加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液17 μL，42 ℃孵育60 min 后終止反應(yīng)，留取產(chǎn)物待用。Real-time PCR 擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s(40 個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動(dòng)計(jì)算出定量結(jié)果，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物列表

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件處理，兩獨(dú)立樣本的資料采用Student’s 雙尾t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心功能檢測(cè)

大鼠心肌梗死模型建立后即刻進(jìn)行基礎(chǔ)心功能檢測(cè)，2組相關(guān)參數(shù)包括LVIDd、LVIDs、LVPWd、IVSd、LVEF的比較沒(méi)有差異性, 見(jiàn)表2。 氯沙坦組與MI組接受相應(yīng)治療2周后再次進(jìn)行心功能檢測(cè)，氯沙坦組LVIDd和LVIDs明顯縮小(P<0.01)，IVSd及LVPWd明顯減少 (P<0.05)，LVEF則顯著增加 (P<0.01)，見(jiàn)表3。

2 心肌組織中Ang Ⅱ濃度的比較

ELISA法檢測(cè)左室心肌組織不同區(qū)域Ang Ⅱ濃度，結(jié)果顯示氯沙坦組Ang Ⅱ濃度在梗死區(qū)和邊緣區(qū)均低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表2 2組大鼠基礎(chǔ)心功能情況的比較

表3 2組大鼠治療2周后心功能情況的比較

*P<0.05,**P<0.01vsMI.

Figure 1.Comparison of Ang Ⅱ level in the left ventricular (LV) cardiac tissue between two groups after treatment. IZ: infarct zone; BZ: border zone; NIZ: none infarct zone. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsMI.

圖1 2組大鼠左心室不同區(qū)域Ang Ⅱ濃度比較

3 心肌組織AT1的變化情況

采用免疫熒光，Western blot及real-time PCR對(duì)心肌組織不同區(qū)域AT1受體表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示氯沙坦組AT1在梗死區(qū)表達(dá)明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

4 心肌組織Cx43的變化情況

采用免疫熒光，Western blot及real-time PCR對(duì)心肌組織不同區(qū)域Cx43表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與MI組相比，氯沙坦組Cx43左室心肌組織不同區(qū)域的表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

5 心肌組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子的變化情況

與MI組相比，氯沙坦組TGF-β1、 Smad 2和Smad 3蛋白水平在左室心肌組織梗死區(qū)和非梗死區(qū)表達(dá)均降低。Smad 7在不同區(qū)域表達(dá)均升高。Real-time PCR結(jié)果顯示：氯沙坦組TGF-β1、Smad 2和Smad 3 mRNA水平在左室心肌組織不同區(qū)域表達(dá)均降低(P<0.01)。Smad 7在不同區(qū)域表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.Comparison of AT1 expression in different areas of left ventricular between two groups. A: immunofluorescence staining of AT1 (green fluorescence); B: Western blot analysis; C: real-time PCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsMI.

圖2 心肌組織不同區(qū)域AT1檢測(cè)結(jié)果

Figure 3.Comparison of Cx43 expression in different areas of left ventricular between two groups. A: immunofluorescence staining of Cx43 (green fluorescence); B: Western blot analysis; C: real-time PCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsMI.

圖3 心肌組織不同區(qū)域Cx43檢測(cè)結(jié)果

討 論

心肌梗死后心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。RAAS的激活促進(jìn)了心室重構(gòu)及心功能惡化[3]。證據(jù)表明在心血管組織局部存在RAAS，并且組織局部RAAS增加與動(dòng)脈硬化、心肌肥厚及充血性心力衰竭等密切相關(guān)[14]。循環(huán)及局部組織 RAAS 的激活導(dǎo)致Ang Ⅱ濃度升高，其通過(guò)與AT1相結(jié)合促進(jìn)血管平滑肌收縮，抑制腎素分泌、增加血管加壓素釋放、刺激心肌肥大、促使心臟纖維化并誘發(fā)心律失常[3,15]。本研究采用左前冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制備大鼠心肌梗死模型，并對(duì)采用氯沙坦治療阻斷AT1以觀察抑制Ang Ⅱ的效應(yīng)對(duì)心肌梗死后心功能的影響。結(jié)扎后的心功能檢測(cè)結(jié)果顯示2組心室內(nèi)徑參數(shù)及左室射血分?jǐn)?shù)均出現(xiàn)心肌梗死后的特征性變化，2組各個(gè)基礎(chǔ)心功能參數(shù)的比較無(wú)顯著差異性。與既往的基礎(chǔ)及臨床研究的結(jié)果相一致， 氯沙坦治療后，大鼠心功能明顯改善，表現(xiàn)為L(zhǎng)VIDd、LVIDs、 IVSd及LVPWd明顯減低，LVEF顯著增高，可見(jiàn)采用血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker, ARB)在受體水平上對(duì)Ang Ⅱ進(jìn)行阻斷有利于改善心肌梗死后心室重構(gòu)及心功能[16]。在本研究中，對(duì)心肌組織Ang Ⅱ和AT1水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ARB治療后心肌組織梗死區(qū)，梗死邊緣區(qū)Ang Ⅱ水平明顯降低，AT1受體水平下調(diào)。Ang Ⅱ與心臟組織中的AT1和血管緊張素Ⅱ 2型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 2，AT2)均能夠進(jìn)行結(jié)合。Ang Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)主要通過(guò)AT1 介導(dǎo)，而Ang Ⅱ作用于AT2則能夠抑制組織重建并發(fā)揮心臟保護(hù)作用[3]。在本研究中，AT1受體阻斷后，梗死區(qū)域局部Ang Ⅱ的濃度出現(xiàn)降低，RAAS活性被抑制，我們考慮可能由于AT1被阻斷后，AT2的比例升高進(jìn)而與Ang Ⅱ結(jié)合增加，由此引起了心臟組織局部中Ang Ⅱ濃度的下調(diào)，而這對(duì)于心室重構(gòu)起到了一定的改善作用。

Figure 4.Expression of the molecules in TGF-β1/Smad signaling in different areas of left ventricular in the two groups. A: Western blot analysis; B: real-time PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsMI.

圖4 2組心肌組織不同區(qū)域TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果

研究顯示Cx43參與心力衰竭的發(fā)生過(guò)程，在心力衰竭晚期，Cx43減少并伴有分布異常[17]?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)血管緊張素對(duì)心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)有調(diào)控作用[7-8]。Ang Ⅱ和Cx43在心肌梗死后心室肥厚和心力衰竭以及心律失常的發(fā)生發(fā)展中均扮演關(guān)鍵角色。在RAAS激活的動(dòng)物模型中，心律失常危險(xiǎn)性同Cx43下降的水平并磷酸化狀態(tài)顯著相關(guān)，而RAAS抑制劑能夠提高Cx43總的水平和磷酸化水平，減少室速的發(fā)生率和改善存活率[7]。在心力衰竭、心肌梗死、心室肥厚等疾病狀態(tài)下均發(fā)現(xiàn)存在Cx43表達(dá)和分布的改變，而Ang Ⅱ受體拮抗劑能夠改善Cx43表達(dá)水平、分布和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改善心室重構(gòu)及減少心律失常的發(fā)生[18]。綜合以上可見(jiàn)Ang Ⅱ?qū)x43的表達(dá)具有調(diào)控作用。在本研究中，我們檢測(cè)心肌梗死后氯沙坦2周治療組及MI組左心室心肌組織不同區(qū)域Cx43表達(dá)量的變化情況，發(fā)現(xiàn)氯沙坦治療組Cx43的表達(dá)在心肌組織不同區(qū)域較MI組明顯升高，并且梗死區(qū)及邊緣區(qū)Ang Ⅱ濃度明顯降低，表明心肌梗死后Ang Ⅱ的增高能夠下調(diào)Cx43表達(dá)。既往已有研究指出，表達(dá)人腎素和血管緊張素原基因的大鼠在Ang Ⅱ的誘導(dǎo)下出現(xiàn)致死性心律失常，同時(shí)伴有Cx43的顯著下降，而經(jīng)氯沙坦治療能明顯改善這些大鼠的電重構(gòu)和減少心律失常的發(fā)生[19]。本研究亦證實(shí)了心肌梗死后Ang Ⅱ的激活下調(diào)了Cx43的表達(dá)，氯沙坦治療能夠逆轉(zhuǎn)這種變化，并且在Cx43表達(dá)上調(diào)的情況下，大鼠心功能也出現(xiàn)了明顯改善。

TGF-β1是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。心肌梗死后心室重塑過(guò)程中TGF-β1表達(dá)增加，Smad被激活，由此促進(jìn)了心肌間質(zhì)纖維化，加重了心肌梗死后心室擴(kuò)張，并最終引發(fā)心功能惡化[20]。研究證實(shí)Ang Ⅱ促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)[21]，應(yīng)用ARB能減弱TGF-β1和Smad的活性，進(jìn)而減輕再灌注心肌的纖維化病變，以達(dá)到對(duì)心肌梗死后心功能的保護(hù)作用[22]。在本研究中，心肌梗死后左心室不同區(qū)域均觀察到TGF-β1水平的增高，氯沙坦治療后其表達(dá)明顯下調(diào)，且TGF-β1的表達(dá)與梗死區(qū)和邊緣區(qū)Ang Ⅱ的濃度呈現(xiàn)一致性的變化，充分說(shuō)明Ang Ⅱ激活導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)上調(diào)，在受體水平阻斷Ang Ⅱ的效應(yīng)后，TGF-β1顯著下降。對(duì)TGF-β1下游分子Smad 2、Smad 3及Smad 7進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smad 2和Smad 3在梗死區(qū)、邊緣區(qū)及非梗死區(qū)均升高，氯沙坦治療2周后水平明顯降低。Smad 7是TGF-β1功能特有的內(nèi)源性抑制因子[23]，正常心肌組織中有豐富的Smad 7表達(dá)，但MI并發(fā)纖維化后，Smad 7的表達(dá)降低，由此可導(dǎo)致TGF-β1信號(hào)的過(guò)度激活[24]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后左心室不同區(qū)域Smad 7表達(dá)下降，并與TGF-β1、Smad 2、Smad 3呈現(xiàn)相反的變化，AT1拮抗劑治療后Smad 7表達(dá)顯著上調(diào)，提示心肌梗死后Ang Ⅱ激活了TGF-β1/Smads并導(dǎo)致Smad 7表達(dá)下降。

TGF-β1不僅作為Ang Ⅱ的下游因子，也調(diào)節(jié)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳遞并影響Cx43的表達(dá)[11]， TGF-β1的水平增高能夠抑制Cx43的表達(dá)，而抑制 TGF-β1可以阻止心臟組織Cx43的低表達(dá)[11, 25]。另有證據(jù)顯示Cx43能夠經(jīng)由競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微管結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)Smad 2和Smad 3 表達(dá)[26]。由此可見(jiàn)，TGF-β1對(duì)Cx43的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在本研究中，心肌梗死后左室心肌組織不同區(qū)域出現(xiàn)Cx43表達(dá)下降，而TGF-β1、Smad 2、Smad 3表達(dá)增高，Smad7表達(dá)降低；用AT1阻斷Ang Ⅱ的效應(yīng)后左室心肌組織不同區(qū)域均出現(xiàn)Cx43表達(dá)上調(diào)，并且TGF-β1、Smad 2、Smad 3水平顯著下降，同時(shí)Smad 7表達(dá)明顯增高。據(jù)此，我們推測(cè)心肌梗死后Ang Ⅱ可能經(jīng)由激活TGF-β1/Smad途徑引起Cx43的表達(dá)下調(diào)，而AT1阻滯劑能夠逆轉(zhuǎn)這種變化。

綜上所述，心肌梗死后Ang Ⅱ的激活引起心室重構(gòu)及心功能惡化；Ang Ⅱ表達(dá)上調(diào)引發(fā)Cx43數(shù)量減少；Ang Ⅱ可能經(jīng)由TGF-β1/Smad通路引起Cx43表達(dá)下降。以TGF-β1/Smad通路作為研究突破口, 將有助于從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控的水平改善心肌梗死后的心肌重構(gòu)并延緩心功能惡化。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Role of TGF-β1/Smad signaling in angiotensin Ⅱ mediated down-regulation of connexin 43

HOU Jing-ying1, ZHOU Chang-qing1, ZHENG Shao-xin2, GUO Tian-zhu1, LONG Hui-bao1, WU Quan-hua1, ZHONG Ting-ting1, WANG Tong1

(1DepartmentofEmergency,2DepartmentofCardiology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:tongwang316@163.com)

AIM: To analyze the alterations of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ), connexin 43 (Cx43), angiotenisin Ⅱ receptor type 1 (AT1) and signaling molecules in the TGF-β1/Smad pathway in different regions of the left ventricular heart tissue for exploring whether Ang Ⅱ regulates Cx43 expression via the TGF-β1/Smad signaling pathway in myocardial infarction (MI) rats.METHODS: MI was induced in 20 male Sprague-Dawley rats by the left anterior descending coronary artery ligation. The rats were then randomized into 2 groups. In the losartan group, 20 mg·kg-1·d-1of losartan were administered for 2 weeks. Heart functions were assessed after surgery and 2 weeks later again following the above treatments. All the rats were sacrificed and relevant molecules, including Ang Ⅱ, AT1, and Cx43 were determined thereafter in diffe-rent areas of the left ventricle. TGF-β1 and its downstream signaling molecules, including Smad 2, Smad 3 and Smad 7, were also detected.RESULTS: In losartan group, both left ventricular internal dimension diastole (LVIDd) and left ventricular internal dimension systole (LVIDs) were smaller, with diminished interventricular septal thickness (IVSd) and left ventricular posterior wall depth (LVPWd) and distinct improvement of left ventricular ejection fraction (LVEF) (P<0.05). Losartan therapy exhibited a reduction of Ang Ⅱ in the infarct zone and the border zone in the cardiac tissues. AT1 was obviously attenuated in the infarct zone with an enhanced expression of Cx43, which was also elevated in the border zone and none infarct zone. TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 were decreased in different zones of the left ventricle, while Smad 7, in contrary to the above factors, presented a converse alteration.CONCLUSION: The activation of Ang Ⅱ provokes downregulation of Cx43 through TGF-β1/Smad signaling pathway in MI rats.

Angiotensin Ⅱ; Connexin 43; Transforming growth factor-β1; Smad; Myocardial infarction

1000- 4718(2016)10- 1729- 08

2015- 12- 24

2016- 02- 24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270213； No.81070125)；廣東省科技計(jì)劃(No.2010B031600032； No.2014A020211002)；高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)中山大學(xué)青年教師重點(diǎn)培育項(xiàng)目(No.13ykzd16); 廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(No.A2016264)

△通訊作者 Tel： 020-34071012； E-mail： tongwang316@163.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.001

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