甲苯對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響研究

何理平，曹彩輝，吳端生

（1.南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，湖南 衡陽(yáng) 421001；

2.湖南省雙峰縣中醫(yī)院，湖南 雙峰 417700）

甲苯對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響研究

何理平1，曹彩輝2*，吳端生1

（1.南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，湖南 衡陽(yáng) 421001；

2.湖南省雙峰縣中醫(yī)院，湖南 雙峰 417700）

為研究甲苯對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響，進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和評(píng)估。結(jié)果表明，甲苯對(duì)紅鯽魚具有一定的遺傳毒性，會(huì)使紅鯽魚的血紅細(xì)胞的微核率，核異常率和總核異常率產(chǎn)生較大的影響。

甲苯；紅鯽魚；血紅細(xì)胞；微核

微核檢測(cè)技術(shù)是有毒物質(zhì)（如甲苯及苯衍生物，除草劑，放射性物質(zhì)等）對(duì)生物細(xì)胞遺傳損傷檢測(cè)的一種非常有用的方法[1-7]。有人用魚類微核試驗(yàn)法評(píng)價(jià)水載污染及魚類的毒性效應(yīng)，認(rèn)為魚類微核率可以迅速可靠地反映出機(jī)體染色體損傷，DNA復(fù)制紊亂等異常狀況。

實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系（red crucian carp C1HD or?laboratory carassius auratus red variety C1HD）是南華大學(xué)吳端生等采用人工雌核發(fā)育技術(shù)培育的一種魚類近交系[8]。具有體型適當(dāng)、體色全紅、繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于作為急性毒性實(shí)驗(yàn)、化學(xué)品毒性檢測(cè)、重金屬污染和農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑污染的監(jiān)測(cè)等實(shí)驗(yàn)魚類。在現(xiàn)代工業(yè)高速發(fā)展的今天，甲苯及苯衍生物對(duì)水的污染也日漸加重，研究甲苯對(duì)紅鯽魚的毒理作用，可以對(duì)水環(huán)境進(jìn)行監(jiān)督，對(duì)保護(hù)人類自身健康有著重要意義[9-10]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系100尾，健康，1.5年齡，平均體長(zhǎng)110.5±9.1 mm，體質(zhì)量45.6±6.4 g，試驗(yàn)前馴養(yǎng)＞2周。試驗(yàn)用魚采用半靜態(tài)方式飼養(yǎng)，魚缸試驗(yàn)用水每天定時(shí)更新一半。

1.2 試驗(yàn)用水及試劑

用水為曝氣3 d自來(lái)水，pH 6.54、溶氧6.21 mg·L-1，水溫（20±4）℃，水中不含甲苯。試驗(yàn)試劑為分析純。

1.3 試驗(yàn)器材

注射器，顯微鏡，燒杯，玻璃棒，載玻片，蓋玻片，增氣泵，紗布，溫度計(jì)，試管。

2 試驗(yàn)方法

2.1 馴養(yǎng)

將紅鯽魚放在試驗(yàn)用的水簇箱中，事先曝氣48 h的自來(lái)水中馴養(yǎng)1周，使魚適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境[11]。

2.2 配制甲苯溶液

根據(jù)前期試驗(yàn)將甲苯濃度設(shè)置為4、8和12 mg·L-13個(gè)濃度[12]。

2.3 染毒

將40條紅鯽魚隨機(jī)分為高、中、低、對(duì)照組4組，每組25條，置一水簇箱中，染毒組分別按12、8、4 mg·kg-1（體質(zhì)量）腹腔注射（從紅鯽魚胸鰭下無(wú)鱗片處小心將藥水推注入魚的腹腔中）不同濃度甲苯溶液，對(duì)照組注射0.2 mL 0.85%生理鹽水。以便于1、3、5、7 d取血制片觀察，計(jì)數(shù)。

2.4 飼養(yǎng)及水環(huán)境的維持

每一水簇箱中放一個(gè)增氣泵來(lái)增氣增氧，每天上午按大約魚體重1%投入磨細(xì)的魚餌料1次，每天換水1次，每次換水1/2～2/3。水溫保持在23～27℃。

2.5 取血制片

從各處理組中取實(shí)驗(yàn)魚用紗布擦干凈，以體側(cè)取血法（將魚側(cè)臥，從軀干部的側(cè)線鱗基部，將注射針呈50°～70°刺入魚體，當(dāng)遇到脊椎骨時(shí)，使針尖刺入兩個(gè)椎體之間，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，便可刺破血管壁，血液隨之進(jìn)入注射器內(nèi)）取血制片。同時(shí)，在注射針筒底部沾少許肝素防止血液凝固[13]。

將血液直接涂在潔凈的載玻片上，自然晾干；甲醇固定4 min，瑞氏染色3 min，緩沖液覆蓋5 min；沖洗，晾干后在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。

2.6 觀察、計(jì)數(shù)和測(cè)定

將血涂片置于油鏡下觀察，計(jì)數(shù)，每張涂片至少數(shù)40個(gè)紅細(xì)胞，分別記錄微核數(shù)、微核細(xì)胞數(shù)、雙核數(shù)、小核數(shù)、無(wú)核數(shù)、其他核異常數(shù)、總異常數(shù)，結(jié)果以千分率表示。其中，微核為圓形或橢圓形，直徑約為主核的1/5～1/4；其他核異常包括核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹、核質(zhì)斷裂、核位置明顯異常等；總核異常數(shù)包括微核數(shù)、雙核數(shù)、小核數(shù)、無(wú)核數(shù)和其他核異常數(shù)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 甲苯對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核及核異常的影響

染毒1、3、5、7 d后對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響見(jiàn)表1～4；染毒對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核、核異常、總核異常數(shù)的影響見(jiàn)圖1～3。

表1 染毒1 d后對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響

表2 染毒3 d后對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響

表3 染毒5 d后對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響

表4 染毒7 d后對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核和核異常的影響

圖1 染毒對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞微核的影響

圖2 染毒對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞核異常的影響

由表1～4可知，分別染毒后，試驗(yàn)組紅鯽魚活力下降，但未出現(xiàn)死亡。隨著甲苯濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，核異常率也明顯在發(fā)生變化；從表1～4與圖1～3中可知，甲苯對(duì)紅鯽魚外周血紅細(xì)胞的微核率、核異常率及總核異常率是具有一定影響的。微核率、核異常率與總核異常率都明顯上升，在用不同濃度的甲苯處理相同時(shí)間或用同一濃度處理不同時(shí)間后，從表1～4可知，紅鯽魚的微核率、核異常率與總核異常率都明顯上升，都明顯高于生理鹽水對(duì)照組的水平。從圖1～3可知，紅鯽魚微核率，核異常率與總核異常率均出現(xiàn)一個(gè)高峰，但并不一致，由圖2可知，各種濃度組核異常率高峰均在第7天。出現(xiàn)高峰的濃度值也不是完全同步的。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于甲苯影響紅鯽魚的途徑很多，抑制紡錘體而產(chǎn)生核異常和使微小核物質(zhì)滯留質(zhì)核外的時(shí)間及程度并不一致所致[13]。

在處理時(shí)間相同的各不同甲苯濃度組中，均以最高濃度組上升最多。由圖1～3可知，在處理1、3和5 d的各濃度中，均以12 mg·kg-1組上升最多。表明甲苯濃度越高對(duì)紅鯽魚的毒害越大，具有一定的劑量效應(yīng)。圖1顯示，高濃度組第3天的微核率較第1天有所下降，原因可能為試驗(yàn)失誤或取材紅鯽魚的個(gè)體差異所致。由圖2可知，第7天高濃度組的核異常率都有所下降而中低濃度組繼續(xù)上升，分析原因可能是紅鯽魚的個(gè)體差異所致，也可能是紅鯽魚對(duì)甲苯的毒害產(chǎn)生了一定的抵抗力。

圖3 染毒對(duì)紅鯽魚血紅細(xì)胞總核異常數(shù)的影響

由表1～3可知，在用同一甲苯濃度處理不同時(shí)間各組的比較中，發(fā)現(xiàn)每一濃度組中，隨著染毒時(shí)間的加長(zhǎng)，紅鯽魚的血紅細(xì)胞微核率均有不同程度的上升，具有一定的時(shí)間效應(yīng)。圖1表明，高濃度組在第3天的微核率有所降低。由圖2可知，在4 mg·kg-1與12 mg·kg-1濃度組中，5～7 d的核異常率有所下降，此現(xiàn)象說(shuō)明紅鯽魚對(duì)甲苯的毒害作用還是有一定抵抗力的，在經(jīng)過(guò)了一段時(shí)間以后，通過(guò)自身的調(diào)節(jié)，機(jī)體排除有害物質(zhì)以減小毒害并且抑制核異常的產(chǎn)生[14]。

4 討論

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，大量的甲苯及苯衍生物也隨著廢棄物進(jìn)入了水體，不僅嚴(yán)重污染了水體環(huán)境；同時(shí)對(duì)水體中的主要?jiǎng)游雉~類，產(chǎn)生了非常嚴(yán)重的危害。魚類又是人類重要的食物來(lái)源，這些受毒害的魚必將通過(guò)食物鏈而最終危害人類自身的健康。

甲苯及苯衍生物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，具有較為強(qiáng)烈的致突變、致畸和致癌作用，同時(shí)又因?yàn)榧妆郊氨窖苌锞哂须y以被生物分解和較高的富集等特性，當(dāng)環(huán)境中甲苯及苯衍生物的含量超過(guò)一定的濃度時(shí)，如果長(zhǎng)期生活在這樣的環(huán)境中，就會(huì)對(duì)包括人類在內(nèi)的所有生物造成極大的毒害作用[15]。

微核實(shí)驗(yàn)是染色體損傷短期突變性試驗(yàn)方法之一，有關(guān)微核的產(chǎn)生原因，不同的學(xué)者雖有不同的表述，但基本上意見(jiàn)是一致的，即微核是細(xì)胞在有絲分裂時(shí)因?yàn)楦鞣N有害因素的損傷，使細(xì)胞核殘留在核外的微小染色質(zhì)塊，一般認(rèn)為無(wú)著絲粒斷片可形成小微核，紡錘體斷裂造成的一條或一組染色體滯后可形成大微核。由于微核與染色質(zhì)的突變具有較為密切的聯(lián)系，因此長(zhǎng)期以來(lái)微核被許多科研工作者用來(lái)作為評(píng)價(jià)毒物，放射性物質(zhì)以及細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)人、動(dòng)物及體外細(xì)胞損傷的指標(biāo)?，F(xiàn)在微核檢測(cè)技術(shù)是檢測(cè)有毒物質(zhì)對(duì)生物細(xì)胞遺傳損傷的一個(gè)非常有用的指標(biāo)，微核率可以迅速、可靠地反映機(jī)體染色體損傷及DNA復(fù)制紊亂等異常狀況[16]。

5 結(jié)論

苯及苯衍生物甲苯對(duì)紅鯽魚具有一定的遺傳毒性，能對(duì)紅鯽魚的血紅細(xì)胞的微核率、核異常率和總核異常率產(chǎn)生較大的影響。

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Effects of Toluene on Micronuclei and Nuclear Anomalies in Red Blood Cells of Red Crucian Carp

HE Liping1,CAO Ca ihui2*,WU Duansheng1
（1.Department of Laboratory Animal,Nanhua University,Hengyang 421001,Hunan,China)
2.Shuangfeng Chinese Medicine Hospital of Hunan Province,Shuangfeng,417700,Hunan,China）

In order to study the effect of toluene on micronuclei and nuclear anomalies in red blood cells of red crucian carp,a series of experiments were done and the test data were analyzed and evaluated.The results showed that toluene had genetic toxicity on red crucian carp,and would impact the red blood cell micronuclei rate,nuclear abnor?mal rate andtotal nuclear abnormalities rate of redcruciancarp.

toluene;red crucian carp;red blood cells;micronucleus

O625.11；Q959.4

A

1001-0084（2016）10-0005-05

2016-09-10

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2013TT2015）

何理平（1980-），女，湖南雙峰人，碩士，講師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)。

*通訊作者