HPLC-UV法測(cè)定苦楝皮中阿魏酸含量*

梅曉丹，鄧仕任，朱夏敏，余佳培，鄭 皓

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

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HPLC-UV法測(cè)定苦楝皮中阿魏酸含量*

梅曉丹，鄧仕任，朱夏敏，余佳培，鄭 皓

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

建立了高效液相色譜-紫外法測(cè)定苦楝皮中成分阿魏酸含量的方法。采用Microsorb C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水-磷酸(24:76:0.1)為流動(dòng)相，流速為1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm，柱溫為40 ℃。結(jié)果顯示,苦楝皮成分阿魏酸的線性范圍為0.002～0.02 mg·mL-1(r=0.9999)，平均回收率(n=9)為100.6%(RSD=1.33%)。結(jié)論：本法采用高效液相色譜，結(jié)合常規(guī)紫外檢測(cè)器，建立了一種準(zhǔn)確可靠，通用性較強(qiáng)的苦楝皮中阿魏酸的含量測(cè)定方法。

高效液相色譜-紫外法；苦楝皮；阿魏酸；含量測(cè)定

苦楝皮為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.或楝MeliaazedarachL.的干燥樹(shù)皮和根皮，性寒，味苦，有毒，歸肝、脾、胃經(jīng)，用于殺蟲(chóng)，療癬[1]。藥理研究表明，苦楝皮具有抗病毒，抗菌，驅(qū)蟲(chóng)和增強(qiáng)免疫力等作用，目前臨床上主要用于腸胃系統(tǒng)等的消化類疾病[2]。目前，從苦楝皮中分離得到的化學(xué)成分有萜類、香豆素、酚酸和甾體等。其中，張淏[3]從苦楝皮的95%乙醇冷浸提取物中，經(jīng)溶劑分步萃取，分離得到阿魏酸?，F(xiàn)代研究表明，阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗病變和防癌等作用[4]，可見(jiàn)阿魏酸是苦楝皮的藥效活性成分之一。目前關(guān)于苦楝皮的主要成分川楝素的含量測(cè)定研究比較成熟，但還沒(méi)有關(guān)于苦楝皮中阿魏酸含量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法測(cè)定不同產(chǎn)地苦楝皮中阿魏酸的含量，為苦楝皮合理用藥、質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試藥

LC-10AT型雙泵高效液相色譜儀，日本島津；SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，日本島津；METTLERAE240型十萬(wàn)分之一分析天平，瑞士METTLER；FA1004B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZDHW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

阿魏酸對(duì)照品,購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司(批號(hào)：l1506030，純度≥99.5%)；甲醇(HPLC), 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

苦楝皮藥材3批，購(gòu)自全國(guó)3個(gè)地區(qū)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王榮祥教授鑒定為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.或楝MeliaazedarachL.的干燥樹(shù)皮。

1.2 色譜條件

色譜柱：Microsorb C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(24:76:0.1)；流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：324 nm，柱溫：40 ℃。理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于6000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇-乙酸(4:1)制成每1 mL含0.1 mg阿魏酸的溶液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.4 供試品溶液的制備

取大約1 g苦楝皮粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱定，放置圓底燒瓶中，再精密加入100 mL甲醇，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻后，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后，濾過(guò)，得到續(xù)濾液，濃縮200倍，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

1.5 線性范圍的考察

精密吸取0.1 mg·mL-1對(duì)照品溶液配成0.002，0.004，0.008，0.016，0.02 mg·mL-1不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取以上對(duì)照品溶液各5 μL，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到回歸方程為Y=3.12×107X+2124.3，r=0.9999，線性范圍0.002～0.02 mg·mL-1。

1.6 精密度試驗(yàn)

取同一份阿魏酸供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行6次連續(xù)進(jìn)樣操作，記錄每次進(jìn)樣的峰面積，計(jì)算RSD。

1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取相同批次的苦楝皮藥材6 份，按1.4項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液并進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定的色譜條件與1.2項(xiàng)色譜條件相同，根據(jù)阿魏酸含量，計(jì)算RSD。

1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一苦楝皮供試品溶液各5 μL，分別在0，2，6，8，12，24 h進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算，考察供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果阿魏酸的RSD=1.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取含量已知的苦楝皮供試品溶液9份，每一組有3份，再稱取13.18 mg對(duì)照品放到100 mL容量瓶中，精密吸取1 mL定容在100 mL容量瓶?jī)?nèi)，再分別向供試品中精密加入阿魏酸對(duì)照品1、2、3 mL作為低、中、高濃度三組不同的樣品，按1.4項(xiàng)下的制備方法制備溶液，測(cè)定各自峰面積用來(lái)計(jì)算含量和加樣回收率。

1.10 樣品的含量測(cè)定

先將不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材粉末過(guò)四號(hào)篩，再分別取各1 g，精密稱定，按1.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成，再按以上色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，利用外標(biāo)法通過(guò)峰面積計(jì)算不同產(chǎn)地藥材中阿魏酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，阿魏酸峰面積的RSD為1.21%，表明本法精密度良好。

表1 精密度考察結(jié)果

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，RSD=1.14%，表明本方法重復(fù)性符合分析要求。

表2 重復(fù)性考察結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，RSD=1.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

平均加樣回收率結(jié)果為100.6%，RSD=1.33%(n=9)，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品的含量測(cè)定結(jié)果

苦楝皮藥材及對(duì)照品的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，色譜峰如圖1所示。

表5 苦楝皮中阿魏酸的含量測(cè)定結(jié)果

圖1 阿魏酸對(duì)照品(A)及苦楝皮藥材(B)的HPLC譜圖

2.6 流動(dòng)相的選擇

研究表明，阿魏酸成分的分離常采用反相色譜法，經(jīng)比較了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸等不同溶劑做流動(dòng)相的分離效果，其中以甲醇-水-磷酸分離效果最好；調(diào)整流動(dòng)相比例為甲醇-水-磷酸(24:76:0.1,V:V:V)、流速1 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間適中，色譜峰分離較好，為最終的分離條件。

2.7 阿魏酸對(duì)照品的配置

文獻(xiàn)表明，溫度、光線、溶劑、放置時(shí)間等因素都會(huì)對(duì)阿魏酸溶液的穩(wěn)定性有一定的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在室溫下以純甲醇、70%甲醇、70%甲醇-冰醋酸(4:1)等不同溶劑配置阿魏酸溶液，以純甲醇、70%甲醇為溶劑的阿魏酸溶液中，雜質(zhì)峰隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，阿魏酸色譜峰逐漸降低，穩(wěn)定性較差。當(dāng)采用70%甲醇-冰醋酸(4:1)配置阿魏酸，穩(wěn)定性有所增強(qiáng)，故選擇70%甲醇-冰醋酸(4:1)配置阿魏酸。光照實(shí)驗(yàn)表明，在光照條件下，阿魏酸迅速降解，而避光條件下，阿魏酸的降解十分緩慢，在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。最終確定在避光條件下以70%甲醇-冰醋酸(4:1)配置阿魏酸對(duì)照品溶液。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)阿魏酸的線性范圍、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等一系列方法學(xué)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等良好，加樣回收率也符合要求(RSD<3%)，說(shuō)明建立的HPLC-UV法測(cè)定苦楝皮中阿魏酸含量的方法準(zhǔn)確可靠，通用性較強(qiáng)，可以為苦楝皮中阿魏酸成分的進(jìn)一步研究提供依據(jù)，同時(shí)也為苦楝皮合理用藥、質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典:一部[M]．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:203-204．

[2] 劉少超,白虹,唐文照,等．苦楝皮化學(xué)成分研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(06):93-96．

[3] 張淏．傳統(tǒng)中藥苦楝皮的化學(xué)成分研究[D]．沈陽(yáng)：沈陽(yáng)藥科大學(xué),2008．

[4] 吳少平,柳小秦,尹琳,等.RP-HPLC法測(cè)定復(fù)方硫酸亞鐵葉酸片中阿魏酸的含量[J]．西北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,40(06):1009-1011.

[5] 王中華．當(dāng)歸中阿魏酸含量測(cè)定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]．河北中醫(yī),2012,34(07):1058-1062．

[6] 楊廣德,梁明金,賀浪沖,等．川芎中阿魏酸的提取方法研究[J]．中成藥,2002,24(06):418-420．

Quantitation of Ferulic Acid in Meliae Cortex Using HPLC-UV*

MEIXiao-dan,DENGShi-ren,ZHUXia-min,YUJia-pei,ZHENGHao

(College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Dalian 116600, China)

A quantitation of ferulic acid in Meliae Cortex by high performance liquid chromatography coupled with UV detector was established.Using Microsorb C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), methanol-water-phosphoric acid (24:76:0.1) as mobile phase, the flow rate was 1 mL·min-1, the detection wavelength was 324 nm, the column temperature was 40 ℃.Results showed that the linear range of ferulic acid was 0.002～0.02 mg·mL-1(r=0.9999), the average recovery rate was 100.6% (n=9), RSD=1.33%.A simple, accurate and reproducible HPLC-UV method was established for determination ferulic acid in Meliae Cortex.

HPLC-UV; Meliae Cortex; ferulic acid; quantitation

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202857)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2015070)；遼寧省自然科學(xué)基金(2015020713)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2015年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510162000044)。

梅曉丹(1993-)，女，2013級(jí)本科生，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?/p>

鄧仕任(1979-)，男，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幣谥?、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

O657

A

1001-9677(2016)019-0135-03