金釵石斛多糖提取工藝研究

余芳，鄭萍，哈清，汪洪濤，蔣彩云

（江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系，江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇南京211168）

金釵石斛多糖提取工藝研究

余芳，鄭萍，哈清，汪洪濤，蔣彩云

（江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系，江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇南京211168）

以金釵石斛為原料，經(jīng)粉碎、脫脂、打漿和超聲波破壁等處理后采取水提取法，通過單因素和正交試驗試驗，研究了水提溫度、超聲波時間、水提時間、料液比對超聲輔助提取金釵石斛中多糖的影響。結(jié)果表明，影響金釵石斛多糖提取因素的主次關(guān)系為：料液比>超聲波時間>水提溫度>水提時間，金釵石斛多糖提取的最佳條件為：料液比1∶25（g/mL）、超聲波時間40min、水提時間120min、水提溫度80℃。

金釵石斛；多糖；超聲輔助提??；正交試驗

金釵石斛是《中國藥典》收載的5種石斛之一，為我國傳統(tǒng)名貴中藥，《本草綱目》中記載其“強陰益精，厚腸胃，壯筋骨，暖水臟，補腎益力，輕身延年”，用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明等癥，具有較高的藥用價值。金釵石斛的主要藥用成分是石斛堿和多糖［1］，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗菌［2-5］等多種功效。傳統(tǒng)經(jīng)驗認(rèn)為，質(zhì)重、嚼之粘牙、味甘、無渣者為優(yōu)品，其多糖含量較高［6］。本文研究了金釵石斛多糖的提取優(yōu)化工藝，旨在為金釵石斛資源開發(fā)利用提供參考。

金釵石斛多糖的提取方法有很多，目前常用的提取方法有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、水提醇沉多糖和酶法。水提法是提取多糖的最常用方法之一，使用較多的是熱水浸提。超聲提輔助取法主要是利用超聲波破壞植物細(xì)胞組織，使之變形、破裂并釋放出內(nèi)含物，同時加速植物有效成分在溶劑中的擴散釋放，促進(jìn)植物有效成分與溶劑混合，有利于萃取。葉余原等［7-9］進(jìn)行了超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究，考察了提取溫度、固液比、提取時間和超聲頻率4個因素對鐵皮石斛多糖提取率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，綜合確定的優(yōu)化提取工藝條件為1∶30（g/mL）的料液比，超聲波功率300 W，45 kHz超聲頻率，提取1.5 h，鐵皮石斛多糖的平均得率為15.3%，鄭斯卓等［10］選定提取溫度、提取次數(shù)和乙醇最終濃度三個因素研究其對金釵石斛多糖提取率的影響。得到多糖浸提的最佳工藝條件為提取溫度為85℃，提取次數(shù)為3次，乙醇終濃度為75%。劉文等［11］在單因素試驗基礎(chǔ)上，以微波頻率、料液比、浸提時間、微波時間為正交試驗的影響因素，以多糖的提取率為評價指標(biāo)，對影響石斛多糖提取工藝的因素進(jìn)行研究。最佳實驗條件是為：微波頻率為1 470 MHz，料液比1∶30（g/mL），浸提時間3 h微波時間10 min。在此條件下，金釵石斛粗多糖得率為4.23%。

我國藥用植物資源十分豐富，是藥物研發(fā)的源泉［12］。近幾年來，金釵石斛多糖以其獨特的作用成為近年來研究的重點。因此，開展金釵石斛多糖的提取分離純化工藝研究，為多糖的醫(yī)療保健功能開發(fā)提供理論依據(jù)。目前，金釵石斛多糖分離純化還處于小批量實驗室階段，而規(guī)?；奶崛?、精制、純化及其應(yīng)用開發(fā)等都需要深入的研究。

1　材料與方法

1.1材料及試劑

金釵石斛：產(chǎn)自貴州遵義。

濃硫酸、苯酚、石油醚、無水乙醇、三氯乙酸、葡萄糖等試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器及設(shè)備

KJ-TBL-5A低速臺式大容量離心機：無錫市瑞江分析儀器有限公司；JY98-ШDN超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波超聲波設(shè)備有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；722S可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DGF30/23-ⅢA型電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京實驗儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取105℃干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100.0 mg，置100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，每毫升含葡萄糖0.1 mg。分別精密取溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置于具塞試管中，分別加水至2.0mL，各加入5%苯酚溶液1.0mL搖勻，迅速加入硫酸5.0 mL搖勻，放置10 min，置沸水浴中加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，紫外分光光度計490 nm波長處測定吸光度，空白對照以2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖溶液。以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、濃度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2金釵石斛粗多糖制備

新鮮的金釵石斛洗凈→粉碎→脫脂→打漿→超聲波細(xì)胞粉碎→超聲輔助提取→熱水浸提→冷卻→離心→取上清液（苯酚-硫酸法測定多糖含量）→上清液真空濃縮至1/3→加入3%的三氯乙酸溶液→搖勻→靜置→離心→得蛋白沉淀和多糖溶液→多糖溶液→加無水乙醇→搖勻→靜置→離心→烘干沉淀→金釵石斛多糖

1.3.3金釵石斛中多糖提取單因素試驗

準(zhǔn)確稱取金釵石斛粉末2 g，加水打漿后超聲破壁處理2 min（作用時間2 s，間歇時間3 s）。通過單因素試驗，考察超聲波時間、水提溫度、水提時間、料液比對金釵石斛多糖含量的影響，采用苯酚-硫酸法［13］測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.1水提溫度

設(shè)定水提溫度50、60、70、80、90℃，超聲波功率200 W，浸提120 min，料液比1∶30（g/mL），超聲波時間40 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.2水提時間

按照料液比1∶30（g/mL），超聲波功率200 W，溫度60℃，超聲波時間40 min，浸提時間設(shè)定90、120、150、180、210 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.3超聲波時間

設(shè)定超聲波時間20、30、40、50、60 min，料液比1∶30（g/mL），超聲波功率200 W，溫度為60℃，浸提120 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.4料液比

按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），超聲波時間40 min，超聲波功率200 W，溫度60℃，浸提120 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.4金釵石斛多糖提取工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以料液比、超聲波時間、水提時間及水提溫度作為4個考察因素，選取3個水平進(jìn)行試驗。采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗設(shè)計，來確定提取最佳工藝。

表1　金釵石斛多糖提取因素水平表Table 1　Levels and factors of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Glucose standard curve

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.340 6x-0.002 2（x為葡萄糖濃度，y為吸光度），線性相關(guān)系數(shù)為：R2= 0.999 1。金釵石斛多糖溶液在此濃度范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)測定多糖含量時，將所測定得到的吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，即能夠計算出所測溶液的多糖含量。

2.2提取條件對得率的影響

2.2.1超聲提取時間對得率的影響

超聲提取時間對得率的影響見圖2。

圖2　超聲提取時間對多糖含量的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on polysaccharides content

由圖2可知，使用超聲波進(jìn)行輔助提取與未使用相比，多糖含量明顯提高；隨著超聲時間的增加，多糖含量呈先上升后平穩(wěn)趨勢。超聲時間在30 min至50 min范圍內(nèi)，多糖含量較為穩(wěn)定，當(dāng)超聲時間為40 min時，多糖含量最高，達(dá)到最大值。李金忠等［14］對超聲輔助提取山藥多糖進(jìn)行研究，該工藝與傳統(tǒng)水提法工藝相比，山藥多糖得率提高了2倍多，同時大大縮短了提取時間。

2.2.2水提溫度對得率的影響

水提溫度對得率的影響見圖3。

圖3　水提溫度對得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides content

圖3的結(jié)果表明，在50℃至80℃范圍內(nèi)，金釵石斛多糖的得率隨著溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，得率不斷增大。這是因為溶液的溶解度隨著溫度增加不斷增大。在80℃之后，金釵石斛多糖的得率隨著溫度的升高呈下降趨勢，得率不斷降低，因而選擇70、80、90℃作為正交試驗的3個試驗水平。

2.2.3水提時間對得率的影響

水提時間對得率的影響見圖4。

圖4　水提時間對得率的影響Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides content

由圖4可知，超聲輔助提取后水提時間在前90 min～150 min內(nèi)，隨著提取時間的延長，金釵石斛中多糖的得率隨之升高，150 min末接近最大值，可見反應(yīng)時間越長，提取越充分。在150 min～210 min，金釵石斛多糖得率下降。因此，選擇水提時間120、150、180 min作為正交試驗的3個水平。

2.2.4料液比對得率的影響

料液比對得率的影響見圖5。

圖5　料液比對得率的影響Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content

由圖5的結(jié)果可知，料液比由1∶20（g/mL）到1∶30（g/mL），多糖得率逐漸增大。當(dāng)料液比為1∶30（g/ mL）時得率達(dá)到5.913%，之后，隨著液體的增多，多糖得率也逐步下降。料液比為1∶40（g/mL）時，多糖得率為4.445%。因此，選擇1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）作為正交試驗的3個水平。

2.3正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2　Result of the orthogonal experiment

續(xù)表2 正交試驗結(jié)果Continue table 2　Result of the orthogonal experiment

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取影響金釵石斛多糖提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9（34）正交表，以超聲波時間（A）、水提溫度（B）、水提時間（C）、料液比（D）作為4個考察因素，選取3個水平進(jìn)行試驗。每一水平K1、K2、K3中最大的值所對應(yīng)的條件即為該因素對應(yīng)的最佳提取條件。由表2可以看出提取金釵石斛多糖的最佳條件為A2B2C1D1，即超聲波輔助提取后水提溫度80℃、超聲波時間40 min、超聲波輔助提取后水提時間120 min、料液比1∶25（g/mL）。4個因素對金釵石斛多糖得率的影響大小依次為：D>A>B> C，其中料液比D的提取作用最為顯著。利用最佳的提取條件，進(jìn)行重復(fù)試驗可使多糖平均得率達(dá)到6.945%。

3　結(jié)論

采用超聲波輔助水浸提金釵石斛多糖，通過單因素試驗和正交試驗結(jié)果分析可得出金釵石斛多糖提取最優(yōu)工藝：超聲波時間40 min，水提時間120 min，水提溫度80℃，料液比1∶25（g/mL）。

利用超聲輔助提取方法，極大程度地縮短了水提時間，并且得到了較高的得率。利用最佳的提取條件，進(jìn)行重復(fù)試驗可使多糖平均得率達(dá)到6.945%。

［1］王康正，高文遠(yuǎn).石斛屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.中草藥，1997，28（10）：633-635

［2］LeeYH.InvitroandInvivoantitumoralphenanthrenesfromthe aerial parts of Dendrobium nobile［J］．Planta Med，1995，61（2）：178-180

［3］ Miyazawa M.Antimutagenic activity of gogantol fromDendrobium nobile［J］.Agric Food Chem，1997，45（8）：2849-2853

［4］黃玲，施紅，章小宛，等.水提和醇提的石斛口服液對衰老藥效學(xué)指標(biāo)的影響［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1996，6（3）：27-30

［5］李滿飛，徐國鈞，吳厚銘，等.金釵石斛精油化學(xué)成分研究［J］.有機化學(xué)，1991，11（2）：219-224

［6］陳曉梅.石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，13（1）：70-751

［7］葉余原.超聲波法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究［J］.中藥材，2009，32（4）：617-620

［8］趙紀(jì)峰，海軍，蘇晶，等.中藥多糖的提取分離工藝研究［J］.重慶中草藥研究，2007，1（1）：29-32

［9］周振鳴.鐵皮石斛多糖的超聲提取工藝研究［J］.中外健康文摘：醫(yī)藥月刊，2008，5（5）：100-101

［10］鄭斯卓，葛小軍，李小瓊，等.金釵石斛多糖含量測定條件和提取工藝的優(yōu)化［J］.2007，46（2）：708-711

［11］劉文，熊耀康.微波輔助提取金釵石斛多糖的工藝研究［J］.中藥材，2005，25（11）：60-61

［12］孫漢董.充分利用天然藥物資源，發(fā)展云南天然藥物［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，20（6）：441-442

［13］張青，張?zhí)烀?苯酚－硫酸比色法測定多糖含量 ［J］.山東食品科技，2004（7）：20-21

［14］李金忠，馬海樂，吳沿友.超聲波提取山藥多糖的研究［J］.糧油食品科技.2005，13（5）：14-15

Study on the Extraction of Dendrobium nobile Lindl Polysaccharide

YU Fang，ZHENG Ping，HA Qing，WANG Hong-tao，JIANG Cai-yun
（College of Food，Jiangsu Institute of Economic＆Trade Technology，Research and Development Center of Food Safety Engineering Technology，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

Dendrobium nobile Lindl was used as raw material after crushing，degreasing，beating，ultrasonic wall-breaking and extracted in water，the effects of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction on single factor as water extraction temperature，ultrasonic time，water extraction time and solid-liquid ratio on ultrasonic assisted extraction were studied.By orthogonal test，the analysis influences Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction of primary and secondary relations of factors were as follows：material liquid ratio> ultrasonic time>water extraction temperature>water extraction time.The results showed that the best conditions for：material liquid ratio 1∶25（g/mL），ultrasonic time 40 min，water extraction time 120 min and water extraction temperature 80℃，and the influence of material liquid ratio on Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction yield was the most significant.

Dendrobium nobile Lindl；polysaccharide；ultrasonic assisted extraction；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.011

江蘇省青藍(lán)工程資助，江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級課題（JSJM1410）

余芳（1970—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

2015-12-24