黑木耳降血脂酸性多糖提取及初步純化的研究

劉榮，程萍，欒淑瑩，趙影，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

黑木耳降血脂酸性多糖提取及初步純化的研究

劉榮1，程萍1，欒淑瑩1，趙影1，王振宇2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

為優(yōu)化黑木耳降血脂酸性多糖的提取工藝，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行研究。選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間為主要影響因素，黑木耳多糖的得率（Y1）和與?；悄懰徕c（STC）結(jié)合率（Y2）為響應(yīng)值，進(jìn)行多個(gè)指標(biāo)同步優(yōu)化。獲得最佳提取工藝參數(shù)為：pH為9.0、料液比為1∶80（g/mL）、提取溫度為71.5℃、提取時(shí)間為2.0 h。在此最佳條件下，多糖得率為3.25%，STC結(jié)合率為19.95%。采用弱堿性的大孔陰離子交換樹脂D315對該多糖進(jìn)行初步純化，有效地對多糖進(jìn)行脫色和脫蛋白處理，提高多糖純度，減少多糖活性成分降解，為黑木耳酸性多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

黑木耳酸性多糖；降血脂；響應(yīng)面；D315樹脂

高血脂癥是指人體中脂質(zhì)代謝不正常，血漿里的脂質(zhì)包括甘油三脂、膽固醇等組分的含量超過正常范圍的病癥，主要誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病等疾?。?］。有研究結(jié)果顯示降低血漿內(nèi)膽固醇含量可減少冠心病得突發(fā)［2］。因此監(jiān)測人體內(nèi)膽固醇含量具有重要意義。體內(nèi)膽固醇降解的主要途徑是通過膽管系統(tǒng)將膽汁酸排出體外［3］。有研究表明多種植物的多糖類物質(zhì)對膽酸鹽具有吸附作用，因此可以通過測定游離膽酸鹽的含量間接得出膽固醇減少的量，進(jìn)而表明降血脂的作用效果［2］。

黑木耳多糖是一種重要的生物活性成分。許多研究顯示，黑木耳多糖具有預(yù)防腫瘤、抗凝血和血栓、降低血糖和血脂等生物活性［4］。不同提取分離方法對黑木耳多糖的得率、純度和生物活性有很大影響。黑木耳多糖的提取方法主要包括熱水浸提、稀堿浸提法，同時(shí)輔以超聲波、微波等多種技術(shù)［5］，多糖的活性結(jié)構(gòu)容易遭破壞。同時(shí)黑木耳多糖脫色及除蛋白經(jīng)常采用化學(xué)方法，但容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，降低多糖活性。

D315樹脂為大孔弱堿性陰離子交換樹脂，用其進(jìn)行脫色的同時(shí)，還可以吸附酸性多糖［6］。因此本試驗(yàn)旨在結(jié)合黑木耳多糖降血脂這一生理功能，優(yōu)化降血脂酸性多糖的提取條件，并用大孔陰離子交換樹脂D315進(jìn)行初步純化，擬在找出黑木耳降血脂酸性多糖最佳的提取條件和純化工藝，為黑木耳多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1原料

黑木耳：市售，產(chǎn)自哈爾濱，經(jīng)除雜、干燥、粉碎，過60目篩，采用石油醚進(jìn)行脫脂24 h，干燥保存。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純；胃蛋白酶（1∶30 000 U）、胰蛋白酶（1∶250 U）：上海源葉生物科技有限公司；?；悄懰徕c：西亞試劑。

1.2.2主要儀器

722可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝儀器公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；XW-80A漩渦混合器：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1黑木耳酸性多糖的提取工藝

原料→提取→3 000 r/min離心→過濾→合并上清液→濃縮→透析24 h→用3倍體積95%乙醇沉淀→離心→真空抽濾去除殘留乙醇→烘干→粗多糖

1.3.2粗多糖得率的測定

采用苯酚-硫酸法［7］。準(zhǔn)確稱取0.1 g的粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，配制成100 mL多糖溶液，稀釋100倍，取2 mL，加入6%的苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻后室溫放置20 min后于490 nm下測OD值，計(jì)算多糖含量以及粗多糖得率。

1.3.3粗多糖與牛磺膽酸鈉的測定

膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸在肝臟中主要是以鹽的形式存在，其中可與牛磺膽酸形成?；悄懰徕c（STC），因此可以通過測定樣品對牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力間接表明其降血脂能力。

?；悄懰徕c（STC）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［8］（略作修改）：取2.0 mL各不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加入6 mL 60%的硫酸，于70℃水浴20 min，冷卻5 min，于387 nm波長處測定吸光度。以吸光值（y）為縱坐標(biāo)，濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=2.010 3x+0.074 9（R2=0.999 3），式中：y為吸光度；x為?；悄懰徕c濃度，單位：μmol/mL。

粗多糖結(jié)合STC能力（W）的測定方法參照文獻(xiàn)［9］，其結(jié)合率計(jì)算公式為：

式中：n1為空白樣上清液中的牛磺酸膽酸鈉濃度，mmol/L；n2為多糖樣品上清液中的?；撬崮懰徕c濃度，mmol/L。

1.3.4單因素試驗(yàn)

選取pH、時(shí)間、料液比、提取溫度為主要影響因素，以黑木耳酸性多糖得率和STC結(jié)合率為考慮指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。其中pH選取7.0、8.0、9.0、10.0、11.0五個(gè)水平；料液比選取1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90（g/mL）五個(gè)水平；提取溫度選取60、70、80、90、100℃五個(gè)水平；提取時(shí)間選取1、2、3、4、5 h 5個(gè)水平。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于目標(biāo)產(chǎn)物為酸性多糖，因此響應(yīng)面試驗(yàn)固定多糖提取液的pH。采用Box-Behnken試驗(yàn)方法進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以得率和STC結(jié)合率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。3個(gè)因素分別為料液比、溫度、時(shí)間，分別編碼為A、B、C，并以+1、0、-1分別代表變量的水平。綜合考慮后以多糖與STC結(jié)合率為主要響應(yīng)值，對各因素的設(shè)計(jì)水平如表1所示。

表1　優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels in CCD

1.3.6D315樹脂初步純化降血脂酸性多糖

1.3.6.1初步純化降血脂酸性多糖

將預(yù)處理好的D315樹脂濕法上柱（柱高40 cm，柱體積200 cm3），吸取上述1.3.2項(xiàng)下供試品多糖溶液70 mL緩緩加入層析柱中，吸附4 h后，先用蒸餾水洗脫，再用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫剩余多糖成分，洗脫液透析脫鹽，醇沉烘干待用。

1.3.6.2純化后多糖理化指標(biāo)測定

1）純度測定

準(zhǔn)確稱取50 mg初步純化后的多糖復(fù)溶于50 mL容量瓶中，測定多糖含量，計(jì)算純度。

2）蛋白質(zhì)含量測定：考馬斯亮蘭法［10］。

3）脫色率測定：分別取純化前和純化后的多糖溶液在420 nm處測其OD值［11］。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1pH對黑木耳降脂多糖提取的影響

圖1為提取溫度為60℃、提取時(shí)間為3 h、提取料液比為1∶60（g/mL）時(shí)，不同pH對黑木耳多糖得率（Y1）及與STC結(jié)合能力（Y2）的影響。

圖1　pH對黑木耳降酯多糖和STC結(jié)合能力的影響Fig.1　Effect of pH on Y1and Y2

由圖1可知pH在7.0到9.0之間，多糖得率增加緩慢；在pH=10.0時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，但隨后多糖得率下降，可能是堿性太強(qiáng)使黑木耳中某些雜質(zhì)溶出度增加，使得多糖得率下降。pH在7.0到11.0之間多糖與STC結(jié)合能力變化比較明顯，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是由于隨著提取液堿性的增強(qiáng)破壞了多糖結(jié)構(gòu)，因此在pH=9.0時(shí)與STC結(jié)合能力達(dá)到最大值。綜合兩者，為了能獲得較多降脂多糖，因此pH選擇9.0。

2.1.2料液比對黑木耳降脂酸性多糖提取的影響

圖2為提取溫度為60℃、提取時(shí)間為3 h、提取液pH=9.0時(shí)，不同料液比對黑木耳多糖得率及與STC結(jié)合能力的影響。

圖2　料液比對黑木耳降酯多糖和STC結(jié)合能力的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on Y1and Y2

由圖2可知，隨著料液比的增加，多糖得率呈現(xiàn)先提高后下降的趨勢，在1∶80（g/mL）時(shí)得率達(dá)到最大值；降脂多糖與STC的結(jié)合能力也呈現(xiàn)相似趨勢，先迅速增加后下降，在1∶80（g/mL）處結(jié)合能力達(dá)到最大。綜合兩者可知，料液比選擇1∶80（g/mL）為宜。

2.1.3提取溫度對黑木耳降脂酸性多糖提取的影響

圖3為提取時(shí)間為3 h、料液比為1∶80（g/mL）、提取液pH=9.0時(shí)，不同提取溫度對黑木耳多糖得率及與STC結(jié)合能力的影響。

圖3　提取溫度對黑木耳降酯多糖的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on Y1and Y2

由圖3可知，多糖得率隨著溫度的升高而增加，在60℃到90℃之間緩慢增加，在100℃時(shí)得率達(dá)到最大；降脂多糖與STC結(jié)合率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在70℃時(shí)結(jié)合率達(dá)到最大值，且在80℃到100℃之間緩慢下降，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于溫度升高導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞。綜合兩者比較，為了獲得較多的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的降脂多糖，故提取溫度選擇70℃。

2.1.4提取時(shí)間對黑木耳降脂酸性多糖提取的影響

圖4為料液比為1∶80（g/mL）、提取溫度為70℃、提取液pH=9.0時(shí)，不同提取時(shí)間對黑木耳多糖得率及與STC結(jié)合能力的影響。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加多糖得率有所增加，在3 h達(dá)到最大值，3 h后曲線趨于平緩；降脂多糖與STC結(jié)合率隨著提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在2 h時(shí)結(jié)合能力達(dá)到最優(yōu)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于時(shí)間過長，多糖物質(zhì)在加熱及攪拌的共同作用下發(fā)生斷裂，影響與STC的結(jié)合。綜合比較，提取時(shí)間選擇2 h。

圖4　提取時(shí)間對黑木耳降酯多糖的影響Fig.4　Effect of extraction time on Y1and Y2

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)軟件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案，需做17組試驗(yàn)來優(yōu)化3個(gè)因素，結(jié)果見表2所示。

表2　Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2　Results of the response surface by Box-Behnken

2.2.2得率模型及方差分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果獲得的二次回歸數(shù)學(xué)模型為：

式中：Y1表示降脂酸性多糖的得率；A表示料液比，g/mL；B表示提取溫度，℃；C表示提取時(shí)間，h。

通過回歸方差分析確定模型的擬合度，結(jié)果見表3所示。

由表3可知，模型的P＜0.000 1，表明這個(gè)二次回歸模型顯著；二次回歸模型的線性相關(guān)（R2）為0.979 5，表明97.95%的可能可以由這個(gè)擬合模型表示；而R2adj為0.953 1，表明只有4.69%的可能性不符合這個(gè)模型，也說明預(yù)測值和試驗(yàn)值的高度相關(guān)；C.V.值越小，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)越可靠，表中C.V.%=2.37表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較好的可靠性。失擬項(xiàng)的P=0.993 4，表明這一項(xiàng)不顯著，模型是適合的。同時(shí)，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對多糖得率影響大小的排序?yàn)樘崛囟龋˙）>提取時(shí)間（C）>料液比（A）。

表3　降脂酸性多糖得率的回歸方差分析Table 3　Variance analysis of the regression equation for Y1

2.2.3STC結(jié)合率模型及方差分析根據(jù)Box-Behnken軟件建立的二次回歸模型為：

式中：Y2為STC結(jié)合率，%；A為料液比，（g/mL）；B為提取溫度，℃；C為提取時(shí)間，h。

黑木耳降血脂酸性多糖與STC結(jié)合能力模型回歸方差分析見表4所示。

表4　降脂酸性多糖與STC結(jié)合能力的回歸方差分析Table 4　Variance analysis of the regression equation for Y2

續(xù)表4　降脂酸性多糖與STC結(jié)合能力的回歸方差分析Continue table 4　Variance analysis of the regression equation for Y2

由表4可知模型的P＜0.000 1，表明這個(gè)二次回歸模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.081 1，表明這一項(xiàng)不顯著。因而該模型的擬合度比較好，可用此模型對提取的黑木耳降血脂多糖與STC結(jié)合能力進(jìn)行預(yù)測和分析。同時(shí)，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對多糖與STC結(jié)合率影響大小的排序?yàn)樘崛r(shí)間（C）>提取溫度（B）>料液比（A）。

2.2.4因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響分析

圖5　各因素對多糖得率和多糖與STC結(jié)合率的影響的響應(yīng)值Fig.5　Response surface plots showing the effect of factors on Y1and Y2

圖5為模型的的三維響應(yīng)圖，從圖中可以直觀地看出各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。由三維圖可知，在所選范圍內(nèi)存在最大值，即響應(yīng)面最高點(diǎn)。在圖a中，提取溫度和料液比相互作用顯著，多糖得率都是隨著二者的增加先迅速升高后趨于緩慢。圖b中，隨著料液比和提取時(shí)間的增加，多糖的得率不斷升高，說明在此范圍內(nèi)，提取時(shí)間和料液比對多糖得率作用顯著。圖c顯示的是提取時(shí)間和溫度對多糖得率的影響，圖中顯示二者對多糖得率作用顯著。圖d顯示的是提取溫度和料液比對多糖與STC結(jié)合率的影響，隨著二者的增加，STC結(jié)合率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。圖e顯示的是提取時(shí)間和料液比對多糖與STC結(jié)合率的影響，從圖中可以看出，提取時(shí)間過長、料液比越大，多糖與STC結(jié)合率越低，說明酸性多糖活性降低。圖f顯示時(shí)間和溫度對多糖與STC結(jié)合率的影響，從中可以看出，提取時(shí)間過長、提取溫度過大，多糖與STC結(jié)合率越低，說明多糖活性損失越多。

綜合多糖得率與多糖與STC結(jié)合率這兩個(gè)指標(biāo)可以得出，由響應(yīng)面預(yù)測模型預(yù)測的最佳提取黑木耳酸性多糖的條件為：pH為9.0、料液比為1∶80.39（g/mL）、提取溫度為71.46℃、提取時(shí)間為2.04 h。預(yù)測多糖得率為3.21%，多糖與STC結(jié)合率為20.00%。

2.2.5預(yù)測模型的驗(yàn)證

根據(jù)最優(yōu)的工藝參數(shù)，再結(jié)合設(shè)備的限制條件，響應(yīng)面模型預(yù)測的最優(yōu)條件修改為：pH為9.0、料液比為1∶80（g/mL）、提取溫度為71.5℃、提取時(shí)間為2.0 h。結(jié)果顯示黑木耳酸性多糖得率的實(shí)測值為3.25%，預(yù)測值為3.23%；與STC結(jié)合率實(shí)測值為19.95%，預(yù)測值為19.98%。預(yù)測值與實(shí)測值非常接近，偏差較小，表明這個(gè)模型和響應(yīng)曲面法來優(yōu)化提取工藝是可行的。

2.3D315樹脂初步純化結(jié)果

用弱堿性的大孔陰離子交換樹脂D315初步純化黑木耳酸性多糖結(jié)果見表5所示。

表5　初步純化結(jié)果Table 5　Result of preliminary purification %

由表5可知，黑木耳酸性多糖經(jīng)D315樹脂處理后，蛋白質(zhì)清除率和脫色率都接近于80%，提高了多糖純度且降血脂活性沒有遭到破壞。因此弱堿性的大孔陰離子交換樹脂D315不僅可以對黑木耳酸性多糖有效地進(jìn)行脫色和脫蛋白處理，提高多糖純度，同時(shí)還可以較大程度的保留酸性多糖的活性成分，對黑木耳多糖進(jìn)行初步純化。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken的響應(yīng)面法建立了3個(gè)影響因素（液料比、提取時(shí)間、提取溫度）與兩個(gè)響應(yīng)值（多糖得率、降血脂活性）相互作用的數(shù)學(xué)模型，得出黑木耳降血脂酸性多糖的最佳提取工藝參數(shù)為pH為9.0、料液比為1∶80（g/mL）、提取溫度為71.5℃、提取時(shí)間為2.0 h。多糖得率為3.25%，STC結(jié)合率為19.95%。為了提高降血脂活性，采用單一熱稀堿浸提黑木耳酸性多糖，得率不是非常高。同時(shí)為了減少多糖的降解，采用較溫和的大孔樹脂吸附法除去多糖的蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)，進(jìn)行初步純化。這些研究能夠幫助我們有效的控制提取工藝條件，保護(hù)降血脂活性物質(zhì)，減少多糖的降解，并對工業(yè)化生產(chǎn)提供一些借鑒，為進(jìn)一步研究黑木耳酸性多糖的分子組成、分子結(jié)構(gòu)以及其降血糖的功能活性提供理論基礎(chǔ)。

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Study on Extraction and Preliminary Purification of Auricularia Acidic Polysaccharide with Reducing Blood Lipid

LIU Rong1，CHENG Ping1，LUAN Shu-ying1，ZHAO Ying1，WANG Zhen-yu2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forest University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

To study the optimal extraction technology of auricularia acidic polysaccharide with reducing blood lipid，the single factor experiment was utilized combined with response surface methodology.The experimental datas were fitted to create two mathematical models describing yield（Y1）and in vitro binding of STC（Y2）obtained at different levels of critical factors，such as extraction temperature and time and material/liquid ratio. The optimum extraction conditions were as follows：pH 9.0，material to water ratio 1∶80（g/mL），extraction temperature 71.5℃，extraction time 2.0 h.Under these conditions，the yield of polysaccharide was 3.25%，the binding of STC was 19.95%.Weak base macroporous anion-exchange resin D315 was used for preliminary purification.The treatment had the effect on discoloration and deproteinized，improveing polysaccharide purity，reducing the degradation of the active ingredient.These can provide a theoretical basis for the further development and utilization of auricularia acidic polysaccharide.

auricularia acidic polysaccharide；reducing blood lipid；response surface；resin D315

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.009

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)技術(shù)項(xiàng)目“黑木耳即食產(chǎn)品開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究”（GA13B202）

劉榮（1971—），女（漢），副研究員，碩士生導(dǎo)師，博士，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)與功能性食品研究。

2016-01-05