蜂膠及其提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的作用

王月華，付崇羅，張麗，玄紅專

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252059）

蜂膠及其提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的作用

王月華，付崇羅，張麗，玄紅專*

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252059）

研究巴西蜂膠、中國(guó)蜂膠乙醇提取物，中國(guó)蜂膠乙酸乙酯及水提取物以及蜂膠中主要組分短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的影響。采用正常培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度、不同提取方法得到的蜂膠及其主要組分分別處理24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，SRB法檢測(cè)細(xì)胞存活率。蜂膠及其各種提取物抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖效果各不相同，中國(guó)蜂膠、中國(guó)蜂膠乙酸乙酯提取物、咖啡酸苯乙酯抑制增殖尤為明顯。蜂膠及其主要組分抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖。

蜂膠；中國(guó)蜂膠乙酸乙酯提取物；中國(guó)蜂膠水提物；3T3-L1細(xì)胞

蜂膠是西方蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂并混入其上顎腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。根據(jù)蜂膠的植物來(lái)源，把世界不同地區(qū)的蜂膠大致分為六類，分別是：楊樹型蜂膠、樺樹型蜂膠、巴西綠膠、紅膠、太平洋蜂膠以及加那利群島蜂膠。盡管不同地區(qū)蜂膠化學(xué)成分相差很大，但目前研究表明，不同地區(qū)的蜂膠具有相似的生物學(xué)活性，如保肝［1］、抗菌［2-3］、抗炎［4］、抗腫瘤［5-7］、降血脂［8］、抑制血小板凝集［9］等，因而目前蜂膠廣泛應(yīng)用于保健品、食品及藥品，用于增進(jìn)健康，預(yù)防疾?。?0］。

中國(guó)蜂膠屬于楊樹型蜂膠，其主要成分為酚酸類和黃酮類化合物。蜂膠難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。目前蜂膠研究主要以蜂膠的乙醇提取物，乙酸乙酯提取物以及水提取物為主，但是基于不同提取方法所得到的蜂膠提取物之間活性的比較研究較少，而且蜂膠是一種復(fù)合物，蜂膠里面至少含有300種以上的化學(xué)成分，目前關(guān)于蜂膠中功效成分的研究還較少。我們前期體內(nèi)外試驗(yàn)均表明，蜂膠具有較好的降血脂功效［11-12］，但蜂膠降血脂，調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常的機(jī)理還不清楚，基于此，本試驗(yàn)通過(guò)比較中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物、中國(guó)蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物以及蜂膠中主要組分如咖啡酸苯乙酯、咖啡酸芐酯、短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的作用，初步研究蜂膠及其主要組分對(duì)前脂肪細(xì)胞的作用。

1　材料和方法

1.1材料

DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；胎牛血清：美國(guó)Hyclone公司；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）：美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板：美國(guó)Falcon公司；Tris：上海生工；其它試劑均為分析純。

中國(guó)蜂膠采自山東省，主要植物來(lái)源為白楊屬。巴西蜂膠為巴西綠膠，主要植物來(lái)源是克魯西屬。分別制備中國(guó)蜂膠乙醇提取物（EECP）、巴西蜂膠乙醇提取物（EEBP）、中國(guó)蜂膠水提物（WEP）、中國(guó)蜂膠乙酸乙酯提取物（EAEP）提取物。短葉松素、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、咖啡酸芐酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素、木犀草素均從中國(guó)蜂膠中分離、提取，并經(jīng)紫外（UV）和核磁共振（NMR）鑒定，純度為98%以上。3T3-L1前脂肪細(xì)胞由聊城大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養(yǎng)箱：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；TE2000S倒置熒光顯微鏡：日本Nikon公司；MK3酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃公司；AR2140電子分析天平：美國(guó)奧豪斯公司；Milli-Q Synthesis超純水：美國(guó)密理博公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)

3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，孵育條件為：5%CO2、37℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2細(xì)胞存活率的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按4 000個(gè)/孔種植到96孔板，37℃，5%CO2孵育，待3T3-L1前脂肪細(xì)胞長(zhǎng)到80%以上，除正常組外所有處理組分別經(jīng)不同濃度的中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物（12.5、25、50 μg/mL），中國(guó)蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物（6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），CAPE和咖啡酸芐酯（2.5、5、10、20、40 μmol/L），短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素（20、40、80 μmol/L）分別處理細(xì)胞24后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測(cè)吸光值。

細(xì)胞存活率/%=（處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS v11.5軟件包統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響見圖1。

圖1　不同濃度的中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig.1　Effect of different concentrations of EECP and EEBP on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖1可以看出，EEBP對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率影響不顯著，而EECP隨著濃度的升高顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖，EECP在濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的抑制率為23%。

2.2不同濃度的中國(guó)蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的中國(guó)蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響見圖2。

圖2　不同濃度的中國(guó)蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig.2　Effect of different concentrations of WEP and ethyl acetate extract of proplis on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖2可以看出，中國(guó)蜂膠乙酸乙酯提取物和水提取物在濃度為6.25 μg/mL～12.5 μg/mL時(shí)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率影響不顯著，但隨著濃度的升高，顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性。此外，同濃度的乙酸乙酯提取物比水提取物更顯著地抑制細(xì)胞增殖。

2.3不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響見圖3。

圖3　不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig.3　Effect of different concentrations of CAPE and caffeic acid benzyl ester on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖3可以看出，不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯在濃度大于5μmol/L時(shí)顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴性。

2.4不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響見圖4。

圖4　不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig.4　Effect of different concentrations of pinobanksin，apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖4可以看出，短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素在20 μmol/L時(shí)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖作用影響不顯著，隨著濃度的升高對(duì)細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)。在80 μmol/L時(shí)，高良姜素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞抑制率達(dá)到24%。

3　討論

目前肥胖已成為危害人類健康的全球性健康問題，它與糖尿病、高血壓、心腦血管疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如今，隨著生活方式的改變，特別是高熱量、高蛋白、高脂肪的攝入，肥胖的人越來(lái)越多，因此，開發(fā)和利用能增加基礎(chǔ)代謝率，抑制體內(nèi)脂肪合成，促進(jìn)脂肪氧化，預(yù)防肥胖的功能性食品，對(duì)提高國(guó)民的生活質(zhì)量，保護(hù)人體健康具有重要的意義。

在中醫(yī)看來(lái)蜂膠是珍貴的天然藥物，它含有600多種成分，是一個(gè)名副其實(shí)的小藥庫(kù)。它由動(dòng)植物精華有機(jī)結(jié)合而成，性味平和、無(wú)毒副作用，可調(diào)節(jié)人體陰陽(yáng)、氣血平衡、“扶正祛邪”、防病治病［13-14］。蜂膠的基本成分是50%的樹脂（黃酮和相關(guān)酚酸），30%的蠟和20%的其他成分［15］。中國(guó)蜂膠主要為酚酸類和黃酮類化合物，而巴西蜂膠主要為香豆酸類物質(zhì)［16］。目前的結(jié)果表明，巴西蜂膠乙醇提取物對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖影響不顯著，而中國(guó)蜂膠乙醇提取物隨著濃度的增加顯著抑制前脂肪細(xì)胞的增殖。不同提取方法的中國(guó)蜂膠對(duì)前脂肪細(xì)胞的影響也不同，乙酸乙酯提取物的抑制功效較乙醇提取物和水提物更顯著。此外，蜂膠中不同的組分對(duì)前脂肪細(xì)胞的影響不同，CAPE和咖啡酸芐酯對(duì)前脂肪細(xì)胞的抑制較其它黃酮類化合物更強(qiáng)，而且不同黃酮類化合物之間，高良姜素的抑制功效更強(qiáng)。由此可以看出，不同來(lái)源的蜂膠，同一來(lái)源不同提取方法的蜂膠以及蜂膠中不同的組分對(duì)前脂肪的影響均不同，需要進(jìn)一步深入的研究。

［1］Basnet P，Matsushige K，Hase K，et al.Four di-O-caffeoyl quinic acid derivatives from propolis.Potent hepatoprotective activity in experimental liver injury models［J］.Biol Pharm Bull，1996，19（11）：1479-1484

［2］ Ivanovska ND，Dimov VB，Bankova VS，et al.Immunomodulatory action of propolis.VI.Influence of a water soluble derivative on complement activity in vivo［J］.J Ethnopharmacol，1995，47（3）：145-147

［3］El-Ghazaly MA，Khayyal MT.The use of aqueous propolis extract against radiation-induced damage［J］.Drugs Exp Clin Res，1995，21（6）：229-236

［4］Khayyal MT，el-Ghazaly MA，el-Khatib AS.Mechanisms involved in the antiinflammatory effect of propolis extract［J］.Drugs Exp Clin Res，1993，19（5）：197-203

［5］Orsolic N，Basic I.Immunomodulation by water-soluble derivative of propolis：a factor of antitumor reactivity［J］.J Ethnopharmacol，2003，84（2/3）：265-273

［6］Han S，Sung KH，Yim D，et al.Activation of murine macrophage cell line RAW 264.7 by Korean propolis［J］.Arch Pharm Res，2002，25（6）：895-902

［7］Suzuki I，Hayashi I，Takaki T，et al.Antitumor and anticytopenic effects of aqueous extracts of propolis in combination with chemotherapeuticagents［J］.CancerBiotherRadiopharm，2002，17（5）：553-562

［8］胡福良，詹耀鋒，陳民利，等.蜂膠對(duì)高脂血癥大鼠血液和肝臟脂質(zhì)的影響［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2004，30（5）：510-514

［9］Serkedjieva J，Manolova N，Bankova V.Anti-influenza virus effect of some propolis constituents and their analogues（esters of substituted cinnamic acids）［J］.J Nat Prod，1992，55（3）：294-302

［10］Sun LP，Chen AL，Hung HC，et al.Chrysin：a histone deacetylase 8 inhibitor with anticancer activity and a suitable candidate for the standardization of Chinese propolis［J］.J Agric Food Chem，2012，60（47）：11748-11758

［11］Xuan H，Li Z，F(xiàn)u C，et al.Propolis reduces phosphatidylcholinespecific phospholipase C activity and increasing annexin a7 level in oxidized LDL-stimulated human umbilical vein endothelial cells［J］. Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：465383

［12］Li Y，Chen M，Xuan H，et al.Effects of encapsulated propolis on blood glycemic control，lipid metabolism and insulin resistance in type2diabetes mellitus（T2DM）rats［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：981896

［13］Sforcin JM，Bankova V.Propolis：is there a potential for the development of new drugs［J］.J Ethnopharmacol，2011，133（2）：253-260

［14］Toreti VC，Sato HH，Pastore GM，et al.Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：697390

［15］Pietta PG，Gardana C，Pietta AM.Analytical methods for quality control of propolis［J］.Fitoterapia，2002，73（1）：7-20

［16］Sun LP，Chen AL，Hung HC，et al.Chrysin：a histone deacetylase 8 inhibitor with anticancer activity and a suitable candidate for the standardization of Chinese propolis［J］.J Agric Food Chem，2012，60（47）：11748-11758

The Proliferation Effect of Propolis and Its Extracts on 3T3-L1 Preadipocytes Cells

WANG Yue-hua，F(xiàn)U Chong-luo，ZHANG Li，XUAN Hong-zhuan*
（School of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

To study the effects of ethanol extract of Brazilian propolis（EEBP），ethanol extract of Chinese propolis（EECP），ethyl acetate extract of Chinese propolis（EAEP）and water extract of Chinese propolis（WEP）and the major constituents of propolis such as pinobanksin，caffeic acid benzyl ester，caffeic acid phenethyl ester（CAPE），apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on 3T3-L1 preadipocytes cells.the normal cultured 3T3-L1 preadipocytes cells were treated with different concentrations of EEBP，EECP，EAEP，WEP and various constituents for 24 h，respectively.The cell viability was measured by SRB method.The inhibitory proliferation effects of propolis and its various constituents on 3T3-L1 cell were different，and EECP，EAEP and caffeic acid phenylethyl ester（CAPE）had a stronger inhibition activity on 3T3-L1 cells.Propolis and its major constituents inhibit the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes cells.

propolis；ethyl acetate extract of Chinese proplis；water extract of Chinese proplis；3T3-L1 preadipocytescells

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201860）；聊城大學(xué)基金（31805，318011317）

王月華（1990—），女（漢），碩士生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。*通信作者：玄紅專（1978—），女（漢），副教授，博士。

2015-12-24