植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的研究與應用

任秀艷，王寶增，王聰艷，侯志敏

(1.廊坊師范學院 生命科學學院,河北 廊坊 065000； 2.河北省高校食藥用菌應用技術研發(fā)中心，河北 廊坊 065000)

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植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的研究與應用

任秀艷1,2，王寶增1，王聰艷1，侯志敏1

(1.廊坊師范學院 生命科學學院,河北 廊坊 065000； 2.河北省高校食藥用菌應用技術研發(fā)中心，河北 廊坊 065000)

液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白是植物體內廣泛存在的一種跨膜轉運蛋白，負責植物體內Na+、H+的交換。本文對Na+/H+逆向轉運蛋白的克隆、分子結構、功能及應用等方面展開論述，旨在為研究者系統(tǒng)的理解Na+/H+逆向轉運蛋白的研究進展，為調控該蛋白的表達來改進植物的生長發(fā)育及抗鹽脅迫能力等方面的應用提供參考。

植物；液泡膜；Na+/H+逆向轉運蛋白；耐鹽性

當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨的逆境脅迫包括生物脅迫和非生物脅迫，其中非生物脅迫中最重要的是土壤的鹽漬化。過多的鹽分會對植物造成滲透壓脅迫和離子脅迫[1]。植物在正常生長情況下，細胞質K+/Na+比例較高，其中K+濃度較高，可達100-200 mM，而Na+離子濃度相對較低，只有1-10 mM[2]。因此，細胞如何將胞質中多余的Na+有效的排出并將Na+積累到液泡中是植物適應鹽脅迫的主要機制，這種機制稱為Na+的區(qū)隔化，是植物在長期的進化過程中形成的。這種區(qū)隔化通常是由Na+/H+逆向轉運蛋白 (Na+/H+antiporter or exchanger, NHX)通過和H+之間交換從細胞質中排除Na+，從而降低過多的Na+對細胞質的毒害，同時Na+也可作為一種有益的滲透調節(jié)劑來降低細胞的滲透壓。大量研究表明，生物界普遍存在這種跨膜轉運蛋白，主要負責植物體內Na+、H+的交換，維持細胞內外Na+濃度的相對穩(wěn)定，調節(jié)胞內pH值，在植物抵抗鹽脅迫中擔負著重要角色[3]。

1 植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的發(fā)現(xiàn)及作用

1.1 植物Na+/H+逆向轉運蛋白的發(fā)現(xiàn)

1985年，Blumwald和Poole在甜菜上發(fā)現(xiàn)了第一個植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白[4]，此后，該蛋白在不同類型植物上逐漸被報道，如鹽生植物堿蓬[5](Suaedaheteroptera)、濱藜[6](Atriplexpatens)、冰葉日中花[7](Mesembryanthemumcrystallinum)、番杏[8](Tetragoniatetragonioides)、鹽芥[9](Thellungiellasalsuginea)、車前[10](Plantagomaritime)等；較耐鹽的甜土植物如大麥[11](Hordeumvulgare)、棉花[12](Gossypiumhirsutum)、玉米[13](zeamays)及擬南芥[14](Arabidopsisthaliana)等。可見，無論在原核生物、真核生物還是在高等動植物中均存在Na+/H+逆向轉運蛋白，并且已經(jīng)從多種生物中克隆到編碼該蛋白的基因，同時對其結構和功能進行了深入研究。但Mennen[15]研究表明，并不是所有的耐鹽植物細胞中都存在Na+/H+逆向轉運蛋白，如在高度耐鹽陸地棉(Gossipiumbirsutum)中沒有檢測到該蛋白活性。

1.2 液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白在植物體內的主要功能

液泡是位于細胞中央的泡狀結構，由膜包被。在細胞質中主要維持細胞內水分平衡，調節(jié)滲透壓，是養(yǎng)料及多種代謝產(chǎn)物積累和貯存的場所，因此該細胞器具有避免有毒物質傷害細胞質的作用。同時，液泡也是植物成熟細胞中最大的細胞器，增加了細胞表面積與體積之比，可使細胞與環(huán)境之間進行充分的物質交換，有利于提高植物的耐鹽性。

1.2.1 離子的區(qū)隔化及細胞質中離子穩(wěn)態(tài)平衡的調節(jié)

植物維持自身正常生長發(fā)育過程中，體內Na+，K+和H+處于相對平衡的狀態(tài)，保持一定的K+/Na+比例，Na+積累過多會對植物體造成傷害，因此，植物體必需將過多的Na+排除體外或區(qū)隔化到液泡中來減少對其自身的傷害。研究表明，植物細胞中多余Na+的區(qū)隔化到液泡主要由Na+/H+逆向轉運蛋白來完成的[14,16,17]，同時將H+從液泡轉移到細胞質，具有調節(jié)細胞質內pH值和Na+濃度的功能[14,18]，這個過程主要依靠液泡膜的兩個質子泵H+-ATPase和H+-PPase產(chǎn)生的質子電化學勢梯度來驅動完成[4,19]。植物體內Na+的區(qū)隔化不但避免了多的Na+對細胞內代謝相關酶類及膜系統(tǒng)造成傷害，而且區(qū)隔化到液泡的Na+可以促使細胞從外界環(huán)境中吸收水分來維持細胞的滲透平衡。可見，植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白在離子區(qū)隔化及離子穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。

1.2.2 調節(jié)細胞液泡的pH

Na+區(qū)隔化到液泡的同時將液泡中的H+轉運到細胞質中，增加了細胞質的pH。研究發(fā)現(xiàn)，日本牽牛(Ipomoeanil)中InNHX1基因的表達與液泡中pH及花的顏色密切相關，pH的改變直接影響花的顏色[20]；當InNHX1基因發(fā)生突變時，液泡pH不變時，相應的花的顏色也沒有變化。隨后，對三色牽牛(Ipomoeatricolar)的研究發(fā)現(xiàn)，在花蕾階段，其花瓣的pH為6.6，顏色為紫色，當花完全開放時，pH為7.7，顏色變?yōu)樗{色，而花瓣液泡膜H+-ATPase、H+-PPase和Na+/H+逆向轉運蛋白的活性明顯增強。這說明液泡膜pH變化和Na+/H+逆向轉運蛋白有關的[21]。此外，Ohnishi等[22]2005年研究日本牽牛發(fā)現(xiàn)，InNHX2除了提高牽牛植株耐鹽性外，對花瓣pH的調節(jié)也有一定作用。

1.2.3 影響植物組織器官的發(fā)育

Apse等2003年對擬南芥AtNHX1的缺失突變體nhx1研究發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，突變體植株的總葉面積縮小、表皮細胞數(shù)量減少、Na+/H+和K+/H+交換活性降低，而將該基因轉入突變體中并過量表達即可使植株基本恢復正常?？梢?，AtNHX1不但可以影響Na+/H+和K+/H+交換活性，還可以影響植物的生長發(fā)育[23]。

2 植物Na+/H+逆向轉運蛋白的基因克隆及分子特征

2.1 植物Na+/H+逆向轉運蛋白基因的克隆

高等植物中第一個克隆到的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因是擬南芥中的AtNHX1[14]，此后，不斷在其他高等植物中克隆到該基因(表1)，但絕大多數(shù)來自甜土植物或鹽生植物。對已克隆的液泡膜NHXs分析表明，在多數(shù)高等植物中，液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白以家族形式存在，由多基因家族控制。而且在多種植物中都有該蛋白的同源基因(homologous gene)存在。如擬南芥中至少有6個(AtNHX1-AtNHX6)[24]，水稻中至少有5個(OsNHX1-OsNHX5)[25]，玉米中有6個(ZmNHX1-ZmNHX6)[13]，大麥中至少有2個(HvNHX1-HvNHX2)[9]，小麥中克隆到3個(TaNHX1-TaNHX3)[26]，番茄中克隆到3個(LeNHX1-LeNHX3)[27]，牽?；ㄖ锌寺〉?個(InNHX1-InNHX2)[28]，楊樹中克隆到2個(PtNHX1,PtNHX6)[29]。對擬南芥中編碼Na+/H+逆向轉運蛋白基因的研究發(fā)現(xiàn)，這6個基因分別在不同的器官中發(fā)揮著各自不同的作用[24]。利用這些蛋白的保守序列設計簡并引物，根據(jù)RT-PCR及RACE方法，從紅小豆(Vignaangularis)幼苗中已成功克隆到液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的同源基因，命名為VaNHX1，作者待發(fā)表。

從表1的結果可以看出，大多數(shù)植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因含有1410-1767個核苷酸的開放閱讀框(Open Read Frame, ORF)，編碼470-589個氨基酸殘基(表1)，推測分子量從47kDa到179kDa不等。如擬南芥AtNHX1分子量為47kDa[14]，而菊芋HtNHX1分子量可高達178.53kDa[30]。由此可見，不同植物由于種屬不同，其液泡膜NHX蛋白的分子量具有不同程度的差異。說明植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白NHXs在進化上可能具有多樣性的特點。

利用DNAstar軟件對表1所列出的植物NHXs進行氨基酸序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)不同植物中Na+/H+逆向轉運蛋白具有不同程度的同源性[13,16,35]。如鹽生植物北濱黎AgNHX1、鹽角草SeNHX1與番杏TtNHX1的同源性很高，而與水稻等甜土植物的NHXs同源性相對較低[25]。而有些植物中存在液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白家族，如擬南芥，玉米及大豆等均克隆到不同的Na+/H+逆向轉運蛋白，NHXs家族成員間的序列同源性也有所差異。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的植物液泡膜NHXs蛋白都屬于細胞內模(Intra-cellular, IC)類的第一類(Class I)，并在細胞內形成一個獨立的轉運子分支，擬南芥中AtNHX1-4屬于Class I類，它們之間有56%-87%的相似性，而AtNHX5和AtNHX6屬于Class II類，它們有79%的相似性，但Class II類與Class I類只有21%-23%的相似性。

表1 已克隆的部分高等植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白

不同植物的NHXs在氨基酸組成上具有一定的保守性，除了珍珠粟PgNHX1外，都具有相同的氨基酸序列LFFIYLL PPI。研究表明，該序列除了在番茄LeNHX1、玉米ZmNHX1及柑橘cNHX1中存在個別氨基酸的差別外，在其他所有植物NHX中都是高度保守的。通過氨基酸序列同源性的比較，分析了不同植物NHXs的進化關系(圖1)。由圖1的進化樹分析可知，番茄LeNHX1與其他植物NHXs親緣關系相對較遠。其它植物液泡膜NHXs可以大致分為5大類群，第I類主要包括豆科植物，如紫花苜蓿MsNHX1、大豆GmNHX1，GmNHX3、綠豆VrNHX1、豇豆VuNHX1等；作者新分離鑒定的紅小豆VaNHX1屬于此群，且與綠豆和豇豆的親緣關系最近。第II類以鹽生植物為主，如鹽角草SeNHX1、冰葉日中花McNHX1、鹽地堿蓬SsNHX1、北濱藜AgNHX1、棉花GhNHX1等；第III類為木本植物，如楊樹PtNHX1、柑橘cNHX1、胡楊PeNHX2等；第IV類為較耐鹽植物如鹽芥ThNHX1、擬南芥AtNHX1及玉米ZmNHX1-6等。第V類以禾本科植物為主，包括小麥TaNHX1-2、水稻OsNHX1-3、大麥HvNHX1、長穗偃麥草AeNHX1等。由此可見，從進化的角度來說，上述這幾個類群的植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白來自于相同祖先，具有共同的進化起源。

圖1 植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析

2.2 植物Na+/H+逆向轉運蛋白的分子結構特征

圖2 AtNHX1的推測拓撲結構模型[46]

Yamaguchi等[46]分析了AtNHX1的拓撲學結構，結果如圖2，AtNHX1由12個跨膜結構域和1個親水的C末端“尾巴”組成，其中跨膜區(qū)TM3、TM5、TM6與膜相連，但并沒有跨過液泡膜，而C末端幾乎都位于液泡腔中。

大量分析表明，盡管不同生物中NHX的分子量、氨基酸數(shù)量、跨膜結構域數(shù)目有所不同，但都具有和擬南芥基本相似的結構特征。其N-端高度疏水，面向細胞質，且疏水區(qū)域較長，而C-端較短且高度親水，形成親水的C末端尾巴，且?guī)缀跞课挥谝号輧?。在該蛋白質家族中，N末端是高度保守的，其保守性對于NHXs的活性很重要；而親水的C末端在不同植物的NHX中變化很大，可能起調節(jié)作用。從拓撲結構上分析表明，來自于不同植物的NHX在結構上極其相似，都由多個跨膜結構域和一個不跨膜的疏水區(qū)組成，在不同植物中該蛋白的跨膜結構域數(shù)量不同，一般為9-12個，其中TM5和TM6與Na+結合，是液泡膜NHXs活性的重要結構域。另外，不同植物的NHX氨基酸的高度保守序列LFFIYLLPPI都位于跨膜結構域上，是氨氯吡嗪咪蛋白的結合位點[47]。

3 Na+/H+逆向轉運蛋白在植物耐鹽性中的作用

3.1 植物Na+/H+逆向轉運蛋白的表達與耐鹽性的關系

鹽脅迫下，高等植物液泡膜NHXs有兩種表達形式:組成型表達和誘導表達。組成型表達是在無鹽條件下蛋白在植株體內即可表達，但活性較低，而鹽處理后其活性明顯增加，多數(shù)鹽生植物屬于此類，如北濱藜、鹽地堿蓬等。誘導表達是在鹽誘導下該蛋白才表達顯示其活性，某些耐鹽植物多為此類，如大麥，向日葵等；如在甜菜懸浮細胞培養(yǎng)液中，隨著NaCl濃度的升高NHX分子數(shù)增加[4]；用高濃度的NaCl處理冰葉日中花及大麥，同樣可誘導冰葉日中花及大麥根部液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白活性上升[7,11]。Pitann等[48]研究表明，高鹽下，抗鹽雜交玉米品種中，ZmNHX表達明顯上調。Kabala等[49]在200 mM NaCl處理的黃瓜根中也檢測到了NHX蛋白的活性。Queirós等[50]發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯細胞培養(yǎng)液，液泡膜NHX同樣受鹽的誘導表達。Silva等[42]研究表明胡楊細胞懸浮液能夠在高達150mM的NaCl培養(yǎng)基中正常生長，而在300mM的鹽濃度下，細胞雖不能生長但卻能保持高度繼代培養(yǎng)17天。大量研究表明，植物體內NHXs的有無及活性的高低與其耐鹽性密切相關。

3.2 轉Na+/H+逆向轉運蛋白基因植物與耐鹽性的關系

由于Na+/H+逆向轉運蛋白在鹽脅迫下能夠誘導表達，利用基因工程手段對該蛋白進行轉基因研究受到了人們的重視。研究表明，將Na+/H+逆向轉運蛋白基因轉到擬南芥中并過量表達，當用濃度為200 mM的NaCI處理時，擬南芥植株仍能正常生長發(fā)育，且液泡膜中Na+濃度AtNHX1活性成正相關，從而進一步證明了Na+在液泡膜中的區(qū)隔化在植物耐鹽脅迫中的重要作用[14]。Zhang等[51]在番茄、油菜中過量表達AtNHX1，得到了世界上第一批真正意義上的耐鹽作物。用200 mM的NaCl處理轉基因植株發(fā)現(xiàn)植株可以正常生長發(fā)育，經(jīng)檢測，大量的鹽分積累到轉基因番茄的葉片，而果實中并未發(fā)現(xiàn)鹽的積累，這保證了果實的品種[52,53]。同樣，將AtNHX1基因轉到甜菜、小麥、玉米及煙草中，其耐鹽性都有不同程度的提高。此外，研究者對其他植物的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的轉基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白的過量表達同樣能增強轉基因植物的耐鹽性。過量表達AgNHX1的轉基因水稻中該蛋白活性是野生型植株的9倍，用高達300 mM的NaCl處理轉基因植株，植株仍可存活[54]。Qiao等[55]研究發(fā)現(xiàn)，過量表達長穗偃麥草AeNHX1的擬南芥和油芥(Festuca)，在250 mM NaCl條件下種子仍能正常發(fā)芽，而野生型則不發(fā)芽。Werma等[56]研究了過量表達珍珠栗PgNHX1基因的水稻，與野生型相比，增強耐鹽性的同時促進了根系的生長發(fā)育。研究表明，植物的耐鹽性是由多基因控制的，但在植物中轉入單基因即可明顯的改善提高植物對鹽脅迫的耐受性，這說明在植物耐鹽基因工程中，Na+/H+逆向轉運蛋白基因具有巨大的潛在應用價值[57]。

由于植物在抵御鹽脅迫過程中可誘導體內多種基因的表達，說明植物的耐鹽性受多基因控制。那么同時過量表達多個基因可能比單個基因能更好的賦予轉基因植物的耐鹽性。Zhao等[58]研究了過量表達鹽地堿蓬SsNHX1及擬南芥AVP1雙基因的水稻，結果發(fā)現(xiàn)，與轉二者之一的單基因相比，轉雙基因的植株具有更強的耐鹽性。Gouiaa等[59]研究表明，在煙草中過量表達小麥TNHX1和TVP1雙元基因，與轉單基因及野生型相比，明顯增強了植株耐鹽性。Brini等[60]在擬南芥中同時過量表達小麥的TNHX1和TVP1，同樣證明了轉雙基因植株獲得了更高的耐鹽性，該結果與文獻[56]的研究結果一致。另外，Zhou等[61]將鹽角草SeNHX1和菠菜(Atriplexhortensis)的甜菜堿合成酶基因BADH構建成雙元表達載體轉入煙草，研究轉基因植株的抗鹽性。結果表明，與轉單一基因的植株相比，鹽脅迫下雙價轉基因植株具有更高的生物量、Na+以及甜菜堿積累量。這些研究結果進一步證明了液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白和H+-PPase在植物耐鹽性中的重要作用。

4 展望

植物在長期的進化過程中形成了復雜的適應鹽脅迫的機制，液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白在植物抵御鹽脅迫中發(fā)揮著十分重要的作用。該蛋白將細胞質中過多的Na+外排進入液泡，同時通過質子泵的作用將H+排到細胞質中，這種作用不但減少過多Na+對細胞質中各類代謝酶的毒害， 而且調節(jié)了細胞滲透勢、維持了細胞內的離子穩(wěn)態(tài)平衡。隨著基因工程技術的迅猛發(fā)展，應用基因工程手段，無論轉單基因還是雙元基因都能不同程度的提高轉基因植物的耐鹽性，這進一步說明了Na+/H+逆向轉運蛋白在植物抗鹽基因工程中的重要作用。目前對該蛋白的研究還不夠深入，至于該蛋白在提高植物耐鹽性過程中，是否和植物體內某些代謝網(wǎng)絡及信號分子有關，還有待進一步研究。今后對液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的研究可以從下面幾個方面進行考慮: 首先，為了全面闡明該蛋白在植物抗逆性和植物生長發(fā)育的調控機制，可以從細胞和分子水平上深入研究此類蛋白的調控網(wǎng)絡、不同調控網(wǎng)絡之間的交叉調控以及其中涉及到的某些重要調控蛋白的功能；其次，通過比較研究不同植物和極端生境下生存的野生植物，來研究液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白在植物適應鹽脅迫中的特殊作用，為抗逆基因資源的發(fā)掘奠定基礎；最后，是否能將已有的某些優(yōu)良抗逆基因與Na+/H+逆向轉運蛋白基因共同轉入某些重要的農(nóng)作物或牧草中，而獲得一批抗逆性強的優(yōu)良轉基因新品種。這將有利于大面積鹽堿地的改良和利用，對于某些極端環(huán)境下的農(nóng)業(yè)發(fā)展尤為重要。

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Research and application of plant vacuolar Na+/H+antiporter

REN Xiu-yan1,2, WANG Bao-zeng1, WANG Cong-yan1, HOU Zhi-min1

(1.CollegeofLifeScience,LangFangTeachersUniversity,LangfangHebei065000,China;2.EdibleandMedicinalFungiResearchandDevelopmentCenterofHebeiUniversities,LangfangHebei065000,China)

Vacuolar membrane Na+/H+antiporter is transmembrane transporter protein which exists widely in plant and is responsible for plants Na+, H+exchange.In this review, we reviewed recent progress on the cloning, molecular structure, function and their uses in plant salt tolerance of Na+/H+antiporter, designed to enable researchers to understand systematically the research progress of Na+/H+antiporter and provided

to improve plant growth and development salt-tolerant through regulating the expression of Na+/H+antiporter.

Plant; Vacuolar; Na+/H+antiporter; Salt tolerance

2016-07-05

河北省科技廳項目(12222902);廊坊師范學院重點項目(LSZZ201203);河北省高等學校遺傳學重點發(fā)展學科項目;廊坊師范學院微生物學重點學科項目

任秀艷(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：生物化學及分子生物學.

1001-9383(2016)03-0039-010

Q943

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