濰縣蘿卜莖葉功效成分分子追蹤及生物活性研究

李桂鳳　張麗　王燕燕　王洪亮　李星星　邱法武

摘要：為探明濰縣蘿卜莖葉的功效成分，追蹤其分子結(jié)構(gòu)，本研究采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析及RP-18色譜柱等對濰縣蘿卜莖葉甲醇提取物進(jìn)行分離和純化，共獲得了18個化合物，分別是芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyceride）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glucoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（choline）、亞麻酸（Linolenic acid）、萊菔素（sulforaphene）、黃酮（F1avone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoicaeid）、十六碳一烯酸（Hexadeeylenic aeid）、十八碳一烯酸（Vaccenic aeid）、十四烷酸（Myristic acid）、亞麻腦苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic aeid）。其中，純度達(dá)95%的亞麻腦苷脂為首次從植物中獲得，并通過理化性質(zhì)分析和Ms、NMR等波譜方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。另外，萊菔素具有重要的生物活性，1mg/mL萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制作用。

關(guān)鍵詞：濰縣蘿卜莖葉；功效成分；分子追蹤；生物活性

中圖分類號：S631.101 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0050-04

濰縣蘿卜是一種食藥皆優(yōu)的常食蔬菜，其莖葉營養(yǎng)豐富，含有大量的活性物質(zhì)。研究表明，蘿卜莖葉中含有的萊菔素，具有很好的防癌抗癌功效及殺菌消炎解毒等作用；含有的糖化酵素，能分解食物中的亞硝胺，可大大降低其致癌作用；含有較多的木質(zhì)素，能使體內(nèi)巨細(xì)胞吞噬癌細(xì)胞的活力提高2～4倍；含有的芥子油和粗纖維，可促進(jìn)胃腸蠕動，推動大便排出；含有的萊釀腦、淀粉酶等成分，具寬胸利氣、健胃消食的功能等。

但由于目前家庭保鮮技術(shù)相對滯后，以及人們習(xí)慣只吃蘿卜而丟掉其莖葉，造成大量資源的浪費，僅濰坊地區(qū)每年就有近15×10²kg的蘿卜莖葉成為垃圾，造成環(huán)境污染。本研究通過對濰縣蘿卜莖葉的功效成分進(jìn)行分子追蹤研究，以期為其綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：濰縣蘿卜莖葉于2014年11月18日采于濰坊市寒亭區(qū)黃埠村，洗凈后50℃烘干，粉碎過20目篩備用。由山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李法曾教授鑒定。標(biāo)本保存于山東綠原農(nóng)業(yè)科技研究院課題組（編號：zxs-188）。

試劑：石油醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZF-6型三用紫外線分析儀（254nm UV燈泡，全套旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀裝置）；超導(dǎo)核磁共振儀Bruker AM-400型；柱層析硅膠（200～300目），薄層層析硅膠GF254（10～40μm）；SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱，輔以5%H₂SO₄-乙醇溶液，加熱顯色。

1.3 分離純化

將干燥粉碎的濰縣蘿卜莖葉（10008g）在室溫下用甲醇浸泡提取4次，每次浸泡4天，合并粗提液（約18L），真空減壓濃縮得到粘稠暗綠色浸膏（約108g）。浸膏用蒸餾水稀釋后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別合并各萃取液（各相均約1800mL），真空減壓濃縮得到石油醚部位61.85g，乙酸乙酯部位28.91g。

經(jīng)硅膠柱分離，石油醚部位，拌樣上300目硅膠柱，進(jìn)行層析，以石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脫：石油醚-氯仿（2：1，V：V，下同）洗脫獲得1～5號化合物，石油醚-氯仿（1：1）洗脫獲得6、7號化合物，氯仿-甲醇（100：1）洗脫獲得8、9、10號化合物，氯仿-甲醇（50：1）洗脫獲得11、12號化合物，氯仿-甲醇（25：1）洗脫獲得13、14號化合物，氯仿-甲醇（10：1）洗脫獲得15號化合物。其中石油醚-氯仿（1：1）洗脫下的產(chǎn)物，干燥后呈現(xiàn)黑兼白色球狀固體，將其用丙酮或石油醚或其混合物洗出白色絮狀物質(zhì)，用甲醇重結(jié)晶得到乳白色粉末結(jié)晶，命名為X16化合物，經(jīng)波譜解析被鑒定為新化合物。乙酸乙酯部位，拌樣上300目硅膠柱，經(jīng)多次硅膠柱層析及氯仿-甲醇（200：1）洗脫，得到17號和18號化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 功效成分的分離鑒定

通過結(jié)晶與重結(jié)晶及色譜純化等方法共分離出18種化合物，經(jīng)理化鑒定、薄層色譜及四大光譜方法鑒定，確定了17種化合物，分別為芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustardacid glyeeride）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinap-ine thiocyanate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glueoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（Choline）、亞麻酸（Linolenic acid）、萊菔素（Sulforaphene）、黃酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Oetadeeadienoie acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenic acid）、十四烷酸（Myristie acid）、亞麻腦苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octade-canoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）。X16化合物為首次從植物中獲得的化合物，本試驗對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析、鑒定。

2.2 X16化合物理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)提取、分離、純化至純度達(dá)95%時，采用Bruker AM-400型超導(dǎo)核磁共振儀測定X16化合物的C、H圖譜，見表1。

經(jīng)波譜解析，X16化合物為白色結(jié)晶狀粉末，10%硫酸乙醇溶液顯色呈現(xiàn)紫黑色斑點。溶于甲醇，微溶于氯仿，不溶于石油醚或丙酮。高分辨電噴霧質(zhì)譜表明其分子式為C₄₈H₉₁NO₁₀，精確分子量842.6738（計算值842.6716，C₄₈H₉₂NO₁₀）。在化合物的核磁共振碳譜中化學(xué)位移為103.4（C-1″）、73.3（C-2″）、76.4（C-3″）、69.9（C-4″）、76.8（C-5″）和60.9（C-6″）的6個碳信號表明分子中存在葡萄糖基。氫譜中化學(xué)位移4.14的端基氫（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），表明該葡萄糖為B構(gòu)型。氫譜中化學(xué)位移1.24處顯示多個亞甲基質(zhì)子信號，碳譜中28.4～29.1處也有多個亞甲基碳信號，表明結(jié)構(gòu)中含有長脂肪鏈；但氫譜和碳譜均只有兩個甲基信號，表明脂肪鏈沒有支鏈。碳譜中化學(xué)位移49.7的碳與胺基（-CH-NH-）相連，表明兩條長脂肪鏈通過胺基相連。

通過以上分析，推測X16為腦苷脂類化合物，其結(jié)構(gòu)為一條長脂肪鏈與一條長脂肪胺鏈相連（見圖1）。核磁共振譜亦顯示存在兩個雙鍵（譜圖中8和9之間對應(yīng)C為129.2和130.2，H對應(yīng)為5.37（2H，m）；15，16之間對應(yīng)C為129.3和129.5，H對應(yīng)為5.32（2H，m），由此可確定兩個雙鍵的具體位置，經(jīng)與文獻(xiàn)對比，該化合物最終被確定為1-氧-（β-D-葡萄糖）-（2S，3S，4R，8E）-2-[（2R）-2-羥基-24酸-15-烯酰胺]-8-18烯-1，3，4-三醇，即亞麻腦苷脂。

2.3 萊菔素的抑菌試驗

萊菔素是一種天然植物抗生素，主要存在于蘿卜種子中，對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、分枝桿菌、百日咳桿菌及大腸桿菌等細(xì)菌以及某些致病性真菌具有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，濰縣蘿卜莖葉中也含有一定數(shù)量的萊菔素，提取后對其抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果進(jìn)行了試驗研究，具體如下。

2.3.1 萊菔素的抑菌試驗方法 萊菔素的抑菌效果采用紙碟法進(jìn)行測定。將保存的菌株移到LB固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨粉10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉3.5g/L，pH7.0）上進(jìn)行活化培養(yǎng)，再在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行批量培養(yǎng)，用無菌水配制成10⁵～10⁶個/mL的菌懸液，在無菌環(huán)境下向每套培養(yǎng)皿（D=9cm）中加入菌懸液1.5mL，迅速倒入約12mLLB培養(yǎng)基。搖勻后冷卻成平板，將蘸有不同濃度酒精（1：2、1：4、1：8、1：16，V：V）稀釋的萊菔素?zé)o菌吸水紙片（D=5mm）放置于平板上，并用浸酒精的吸水紙做陰性對照，以鏈霉素做陽性對照，置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個濃度處理重復(fù)3次。分別于24、48h測量抑菌圈大小，評價抑菌效果。

2.3.2 萊菔素的抑菌效果 不同濃度萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果見表2。濃度越大，抑菌圈越大，抑菌效果越好。1.0mg/mL萊菔素基本可以完全抑制菌體生長。

3 結(jié)論與討論

濰縣蘿卜的莖葉經(jīng)50℃烘干，粉碎，浸提，30℃蒸干，萃取，分離，純化，獲得芥子油（Mustardoil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyeer-ide）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitoster01）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glucoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（Choline）、亞麻酸（Linolenicacid）、萊菔素（Sulforaphene）、黃酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoic acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenicacid）、十四烷酸（Myristic acid）、亞麻腦苷脂（Li-Hum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）18個化合物。其中亞麻腦苷脂具有重要的生物活性，本試驗為亞麻腦苷脂首次從植物中獲得。此外，萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果試驗顯示0.6～1.0mg/mL萊菔素的抑菌效果明顯。