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    水稻α—NAC基因家族的克隆及生物信息學(xué)分析

    2016-11-19 08:41:24王曉靜孫林靜馬忠友孫玥李軍玲張融雪閆雙勇劉學(xué)軍
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析水稻

    王曉靜 孫林靜 馬忠友 孫玥 李軍玲 張融雪 閆雙勇 劉學(xué)軍

    摘要:新生多肽結(jié)合復(fù)合體(Nascent polypeptide-associated complex,NAC)是由d和B兩個(gè)亞基組成的異二聚體復(fù)合物。水稻新生多肽結(jié)合復(fù)合體α鏈基因家族共有3個(gè)基因,分別位于1、3號(hào)和5號(hào)染色體上。本研究根據(jù)公布的水稻基因組序列,通過(guò)RT-PCR方法克隆了粳稻品種中花11號(hào)中α-NAC家族的3個(gè)基因。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),水稻α-NAC基因家族的氨基酸序列比較保守,包含NAC和UBA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,與玉米NAC基因家族的親緣關(guān)系最近。OslgNAC和Os3gNAC、Os5gNAC的相似性分別為67.4%、81.8%,Os3gNAC和Os5gNAC的相似性為69.5%。本研究結(jié)果為Osα-NAC蛋白純化及蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供參考,為今后Osα-NAC基因家族的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:水稻;新生多肽結(jié)合復(fù)合體α鏈;生物信息學(xué)分析

    中圖分類(lèi)號(hào):S511+Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2016)04-0008-06

    新生多肽結(jié)合復(fù)合體(Nascent polypeptide-associated complex,NAC)由α鏈和β鏈組成,在體內(nèi)和體外均可以形成一個(gè)穩(wěn)定的有功能的復(fù)合體。根據(jù)不同物種的同源序列比較發(fā)現(xiàn),NAC有一段非常保守的結(jié)構(gòu)域,稱為NAC結(jié)構(gòu)域,一般位于亞基的N端。NAC的兩個(gè)亞基都可以在核糖體上與新生多肽直接作用,是核糖體輸出通道的動(dòng)力組成部分,給新生多肽的形成提供保護(hù),阻止不合適的蛋白相互作用。在人的造骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)α-NAC雖然本身不是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,但它可能具有共激活某些轉(zhuǎn)錄因子的功能。為了行使轉(zhuǎn)錄共激活子功能,α-NAC能夠在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中穿梭。因此,α-NAC被認(rèn)為是具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯雙重功能的蛋白。

    近年來(lái),植物中對(duì)β-NAC的研究報(bào)道逐漸增多。從辣椒(Capsicum annuum)中克隆到和β-NAC同源性很高的CaBTF3,其對(duì)辣椒的HR抗病機(jī)制有作用。與對(duì)照辣椒植株相比,受煙草花葉病毒侵染的CaBTF3沉默辣椒植株中,HR導(dǎo)致的壞死細(xì)胞數(shù)量減少,同時(shí)HR相關(guān)基因的表達(dá)量下降,煙草花葉病毒的外殼蛋白量增加。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)互花米草(Spartina alterniflo-ra)的β-NAC后,在正常生長(zhǎng)環(huán)境下,轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育狀況不受影響,但是在鹽害和干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力。在小麥中,BTF3(β-NAC)沉默的轉(zhuǎn)基因植株不耐干旱和凍害。在水稻中,BTF3(β-NAC)對(duì)種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的功能,OsBTF3沉默的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)受到明顯抑制,花粉活力和種子數(shù)量明顯減少。有人通過(guò)分子克隆的方法從水稻中得到OsBTF3基因,對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析,并獲得了OsBTF3過(guò)表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻,對(duì)OsBTF3在抗病性、抗逆性和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。α-NAC和β-NAC以異源二聚體的形式存在于植物細(xì)胞中,推測(cè)α-NAC也具有重要的生理功能。雖然α-NAC在植物物種中廣泛存在,但其生物學(xué)功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

    本研究根據(jù)網(wǎng)站http://rice.plantbiology.mSU.edu公布的水稻基因組序列信息,利用Prim-er Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物,采用RT-PCR方法從粳稻品種中花11號(hào)中分別克隆得到α-NAC家族三個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA,并通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)α-NAC基因家族的同源基因進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    粳稻品種中花11號(hào)種植于上海市植物生理生態(tài)研究所人工氣候室。大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存;TRIZOL為Invitrogen公司產(chǎn)品;Rever Tra Aceα為T(mén)oyobo公司產(chǎn)品;EX Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker及pMD19-T載體為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品;引物合成和基因測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

    1.2 Ostr-NAC基因家族的克隆

    1.2.1 水稻總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取水稻三葉期新鮮葉片加液氮研磨至粉末,每50~100mg材料加入1mL TRIZOL(Invitro-gen),振蕩混勻,依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取,電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量,紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280nm下的吸光值,計(jì)算總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板,Oligo(dT)為引物,按照Rever TraAce僅(Toyobo)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:5×RT Buffer 4μL,dNTP混合物(各10mmol/L)2μL,RNase抑制劑(10U/μL)1μL,Oligo(dT)20(10pmol/μL)μL,反轉(zhuǎn)錄酶1μL,總RNA2~3μg,加Nuclease-free去離子水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為:42%反應(yīng)1h。產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 基因的克隆及測(cè)序

    根據(jù)網(wǎng)站公布的水稻基因組序列信息,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物(表1),以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL,反應(yīng)條件為:94℃10min;94℃30s,56~60℃30s,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。

    按照TaKaRa公司的pMD19-T載體說(shuō)明書(shū),將切膠回收的目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接液體系為10μL:連接液5μL,載體0.5μL,回收DNA的量2.5μL,去離子蒸餾水2μL。16℃連接過(guò)夜。取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50t感受態(tài)細(xì)胞,取細(xì)胞懸浮液涂布于含Amp的LB平板上,37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落,進(jìn)行PCR檢測(cè)。挑選陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)水稻基因組注釋項(xiàng)目網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu)上Osα-NAC基因家族3個(gè)基因的相關(guān)信息,使用BioEdit和ORFFinder分別分析cDNA的堿基組成和開(kāi)放閱讀框(ORF)。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上搜集擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、果蠅(Drosoph-ila melanogaster)、古細(xì)菌(Methanothermobactermarburgensis)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、小鼠(Mus musculus)和人類(lèi)(Homo sapiens)等物種α-NAC的氨基酸序列,并進(jìn)行同源性比較。通過(guò)MEGA5.1軟件將19個(gè)α-NAC蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析,根據(jù)鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Osα-NAC基因的序列分析

    Osα-NAC基因家族共有3個(gè)成員,分別位于1、3號(hào)和5號(hào)染色體上,根據(jù)其在染色體的分布位置分別命名為OslgNAC、Os3gNAC和Os5gNAC。依據(jù)水稻基因組注釋項(xiàng)目網(wǎng)站的注釋及序列分析得知,OslgNAC的全長(zhǎng)DNA為2759bp,包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,5-UTR長(zhǎng)112bp,3-UTR長(zhǎng)281bp,蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)609bp,預(yù)測(cè)的編碼蛋白有203個(gè)氨基酸殘基(圖1A)。Os3gNAC的全長(zhǎng)DNA為2251bp,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,5-UTR長(zhǎng)159bp,3-UTR長(zhǎng)1090bp,蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)666bp,預(yù)測(cè)的編碼蛋白有222個(gè)氨基酸殘基(圖1B)。Os5gNAC的全長(zhǎng)DNA為2119bp,包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,5-UTR長(zhǎng)81bp,3-UTR長(zhǎng)432bp,蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)618bp,預(yù)測(cè)的編碼蛋白有209個(gè)氨基酸殘基(圖1C)。

    2.2 Osα-NAC基因的克隆

    使用設(shè)計(jì)的引物分別以水稻全長(zhǎng)cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示,片段大小與預(yù)期相符(圖2)。將目的片段切膠回收,與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,各挑選2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與網(wǎng)站公布的序列結(jié)果一致。

    2.3 α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析

    2.3.1 不同物種α-NAC氨基酸序列同源性分析人類(lèi)、線蟲(chóng)、酵母都只含有一個(gè)α-NAC基因,水稻和擬南芥在進(jìn)化過(guò)程中分化出多個(gè)α-NAC的同源基因。不同物種α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析(圖3)表明,α-NAC的氨基酸序列比較保守,包含NAC和UBA(Ubiquitin-associ-ated)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別處于肽鏈的N端和C末端。

    2.3.2 水稻和擬南芥α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析水稻和擬南芥不同α-NAC蛋白之間的氨基酸序列相似性差別不大,在50%~85%之間(表2),其中AtNACA1和AtNACA3之間的氨基酸序列相似性最高,達(dá)到了84.8%,而AtNACA1和AtNACA5之間的相似性最低,為53.6%。在進(jìn)化樹(shù)分析中,水稻的Os1gNAC和Os5gNAC親緣性最近,氨基酸序列比較顯示它們的序列相似性達(dá)到了81.8%,說(shuō)明它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

    2.4 α-NAC的系統(tǒng)進(jìn)化分析

    對(duì)α-NAC蛋白的進(jìn)化分析(圖4)表明,古細(xì)菌α-NAC(aeNAC)單獨(dú)成為一個(gè)分支,之后又進(jìn)化出酵母(EGD2)和其余物種的僅一NAC蛋白,說(shuō)明古細(xì)菌α-NAC屬于α-NAC基因家族出現(xiàn)較早的基因。在另一節(jié)點(diǎn)上,可以看到植物α-NAC蛋白和動(dòng)物α-NAC蛋白在進(jìn)化上形成兩個(gè)不同的分支。Os1gNAC和Os5gNAC的親緣關(guān)系比較近,與玉米的3個(gè)NAC蛋白(Zm1NAC、Zm2NAC、Zm3NAC)屬于同一個(gè)分支,而Os3gNAC和它們的親緣關(guān)系則比較遠(yuǎn),與玉米的另一個(gè)NAC蛋白(zm4NAC)屬于同一個(gè)分支。

    3 結(jié)論與討論

    NAC是廣泛存在于細(xì)菌、動(dòng)物和植物中的保守蛋白,由α和β兩條鏈組成。不同物種α-NAC含有不同數(shù)目的同源基因,植物α-NAC基因家族較龐大。本研究通過(guò)RT-PCR方式從水稻中成功克隆得到Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因,根據(jù)其所在染色體的位置,分別命名為Os1gNAC、Os3gNAC和OsggNAC。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因全長(zhǎng)DNA大小分別為2759、2251bp和2119bp,都包含有外顯子和內(nèi)含子。不同物種的氨基酸同源序列比較發(fā)現(xiàn),α-NAC基因家族的氨基酸序列比較保守,包含NAC和UBA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中位于亞基N端的NAC結(jié)構(gòu)域在α-NAC和β-NAC中均存在,而UBA結(jié)構(gòu)域則只在α-NAC的C端存在。對(duì)α-NAC蛋白的進(jìn)化分析表明,古細(xì)菌α-NAC屬于α-NAC基因家族出現(xiàn)較早的基因。Os1gNAC與Os5gNAC的親緣關(guān)系比較近,而Os3gNAC與它們的親緣關(guān)系則比較遠(yuǎn)。

    本研究首次報(bào)道了Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因,克隆得到的產(chǎn)物和生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)將對(duì)以后的研究工作提供試驗(yàn)材料和科學(xué)依據(jù),為水稻抗逆新品種的培育及利用基因工程手段改良水稻提供優(yōu)良的基因資源。

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