菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌檢測(cè)方法

楊柳 張 一 王磊

摘要：對(duì)菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌——菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測(cè)方法進(jìn)行研究。比較菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌的檢測(cè)方法，結(jié)果表明：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法應(yīng)用于菜豆檢疫性細(xì)菌檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且特異性強(qiáng)，靈敏度高。對(duì)保障國(guó)家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、保護(hù)我國(guó)農(nóng)村菜豆種質(zhì)資源的安全起到重要作用。

關(guān)鍵詞：菜豆萎蔫病菌；菜豆暈疫病菌；檢測(cè)；溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

基金項(xiàng)目：吉林工商學(xué)院基金項(xiàng)目（院理科合字〔2015〕第006號(hào)）

中圖分類號(hào)： S435.24 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.08.058

菜豆又名四季豆、蕓豆、飯豆，為豆科、碟形花亞科、菜豆族、菜豆屬的普通種[1]。

中國(guó)是菜豆的主要生產(chǎn)國(guó)，也是主要出口國(guó)，特別是隨著國(guó)家種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，菜豆生產(chǎn)已成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民增收的重要途徑之一[2]。普通細(xì)菌性疫病是影響全世界菜豆生產(chǎn)的主要病害之一，一般可導(dǎo)致20%～60%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失率高達(dá)80%[3]。本文針對(duì)菜豆中菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌兩種檢疫性細(xì)菌的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，旨在為菜豆種質(zhì)資源的安全起到一定作用。

1 菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)

目前許多國(guó)家針對(duì)菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌常用的鑒定檢測(cè)方法包括選擇培養(yǎng)基分離檢測(cè)法、血清學(xué)測(cè)定、免疫熒光菌落染色法、PCR技術(shù)等[3]。

1.1 選擇培養(yǎng)基分離檢測(cè)法

趙友福等[4]對(duì)菜豆萎蔫病菌的種子檢驗(yàn)鑒定技術(shù)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)523，NBY+ TTC和NBY+剛果紅三種培養(yǎng)基均可作為分離培養(yǎng)基，對(duì)帶菌種子分離的靈敏度為1.8×102cuf/m1。

1.2 血清學(xué)測(cè)定法

趙友福等[5]對(duì)菜豆萎蔫病菌的血清檢測(cè)鑒定技術(shù)進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)19個(gè)Cff菌株和其他6個(gè)屬14個(gè)種的植物病原細(xì)菌20個(gè)菌株的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約50%的Cff菌株為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。血清學(xué)檢測(cè)靈敏度為4.5×104 cfu/ml。

1.3 免疫熒光菌落染色法

高泉準(zhǔn)[6] 研究了菜豆萎蔫病免疫熒光菌落染色法快速診斷技術(shù)，靈敏度高達(dá)1.23×107cuf/m1，且可分離出括的菌株。

1.4 PCR檢測(cè)法

張曉梅等[7]研究了菜豆萎蔫病菌的PCR檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，在100pg的基因組濃度下仍能檢測(cè)到很強(qiáng)的條帶。

1.5 傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)

在上述檢測(cè)方法中，選擇培養(yǎng)基分離檢測(cè)法檢測(cè)周期較好，而且檢測(cè)步驟較繁瑣。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖然效果好，檢測(cè)過(guò)程易操作，但是檢測(cè)目標(biāo)單一。免疫熒光菌落染色法檢測(cè)周期長(zhǎng)、反應(yīng)靈敏度低。PCR檢測(cè)法雖然特異性較強(qiáng)，靈敏度較高，但是測(cè)量時(shí)使用的設(shè)備較昂貴，需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室完成，操作過(guò)程較繁瑣，不適合于在基層進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，急需開發(fā)特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、適用于基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法。

2菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌LAMP檢測(cè)新技術(shù)

2.1 LAMP技術(shù)簡(jiǎn)介

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是在65℃恒溫條件下進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增，利用兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物識(shí)別靶基因上的六個(gè)區(qū)域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，幾十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增。

2.2 LAMP技術(shù)用于菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

2.2.1 可實(shí)現(xiàn)基層現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè) 利用LAMP技術(shù)開發(fā)菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測(cè)方法及配套試劑盒，只需對(duì)檢測(cè)菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌進(jìn)行簡(jiǎn)單的DNA提取，就可以完成直接的擴(kuò)增和檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程只需配一臺(tái)普通的水浴鍋，就可以在基層進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)，特別適用于農(nóng)村及偏遠(yuǎn)山區(qū)等進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測(cè)。

2.2.2 檢測(cè)靈敏度高 與常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比，LAMP檢測(cè)靈敏度通常是常規(guī)PCR的10～100倍。

2.2.3 檢測(cè)速度快 利用LAMP技術(shù)檢測(cè)菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌，基本反應(yīng)時(shí)間可以控制在60～90分鐘內(nèi)。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入環(huán)引物，反應(yīng)時(shí)間可以縮短到30～45分鐘。

2.2.4 特異性強(qiáng) 利用LAMP方法進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測(cè)，需要在Genebank 上找到菜豆萎蔫病菌、菜豆暈疫病菌的保守序列，采用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)5組特異引物。與靶序列上的6個(gè)特異性部位進(jìn)行準(zhǔn)確結(jié)合發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比，特異性更強(qiáng)。

2.2.5 可實(shí)現(xiàn)視化檢測(cè) 利用LAMP方法進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測(cè)，在檢測(cè)體系中可加入熒光染料——鈣黃綠素，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生綠色熒光，可以通過(guò)肉眼直接判斷。

3 結(jié)論

LAMP檢測(cè)技術(shù)非常適用于進(jìn)行菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌的檢測(cè)。LAMP技術(shù)的應(yīng)用必將推動(dòng)基層、農(nóng)村、偏遠(yuǎn)地區(qū)菜豆中重要檢疫性細(xì)菌的檢測(cè)向著更低廉、更方便、更準(zhǔn)確的方向發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]馮國(guó)軍，徐啟江，李玉花，等.普通菜豆SSR反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38（01）：27-34.

[2]馮佰利，魚歡，高小麗，等.中國(guó)蕓豆品牌發(fā)展戰(zhàn)略研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（16）：454-457.

[3]徐新新.菜豆普通細(xì)菌性疫病菌原學(xué)研究及抗病種質(zhì)資源鑒定[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[4]趙友福，高泉準(zhǔn)，陳紅燕，等.菜豆萎蔫病菌的種子檢驗(yàn)鑒定技術(shù)研究[J].植物檢疫，1997，11（03）：129-133.

[5]趙友福，陳紅燕，張樂(lè)，等.菜豆萎蔫病菌的血清檢測(cè)鑒定技術(shù)研究[J].植物檢疫，1997，11（04）：193-198.

[6]高泉準(zhǔn).菜豆萎蔫病免疫熒光菌落染色法快速診斷技術(shù)研究[A].中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)第六屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)病理學(xué)會(huì).1998：629-631.

[7]張曉梅，林友偉，吳新華，等.菜豆萎蔫病的PCR檢測(cè)技術(shù)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（03）：42-45.