基于大鼠室性早搏心臟毒性的附子質(zhì)量生物評價方法研究

趙志浩+張定堃+吳明權(quán)+李春雨+曹麗娟+張萍+劉翠哲+王伽伯+肖小河

[摘要]附子是確有療效的毒劇類中藥，構(gòu)建關(guān)聯(lián)臨床毒副反應(yīng)的質(zhì)量評價方法對提高其炮制減毒質(zhì)控水平和保障臨床安全性具有重要意義。該文針對附子可導(dǎo)致室性早搏這一早期心臟中毒反應(yīng)，構(gòu)建基于大鼠室性早搏（premature ventricular contractions，PVC）最小中毒量（minimal toxic dose，MTD）測定的附子炮制品質(zhì)量生物評價方法，通過影響因素考察優(yōu)化方法學(xué)（動物性別、體重、對照品穩(wěn)定性與供試品穩(wěn)定性），檢測結(jié)果的重現(xiàn)性符合藥品質(zhì)量生物評價要求。應(yīng)用該方法檢測生附子及其不同炮制品黑順片、白附片、蒸附片、刨附片、炮天雄致大鼠室性早搏MTD，結(jié)果表明，生附子炮制后MTD均顯著升高（P<0.05），其中黑順片、蒸附片、刨附片與白附片的MTD分別為生附子的15.76，22.36，19.65，20.97倍；而炮天雄幾乎無毒，用該方法檢測不出MTD。該方法可以比較好的反映附子及其炮制品的整體心臟毒性。進(jìn)一步結(jié)合附子炮制品的化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)炮制品中雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，以及單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿與PVC呈顯著相關(guān)。此外，可能還存在其他與致心律失常相關(guān)的未測成分，值得深入研究。上述研究為附子臨床早期心臟毒性評價與質(zhì)量控制提供了整體、綜合的方法，可作為化學(xué)評價方法的有益補(bǔ)充，為保障附子臨床應(yīng)用的安全性提供了新的方法。

[關(guān)鍵詞]附子； 生物評價； 心臟毒性； 室性早搏； 最小中毒量； 質(zhì)量控制

[Abstract]Aconiti Lateralis Radix （Fuzi） is a toxic traditional Chinese medicine with definite efficacy. In order to improve the quality control of its different prepared products and ensure the security in clinic， it is significant to establish a method of quality evaluation related to clinic adverse effects. Aiming at the important biological marker of early cardiac toxicity reaction， there was no method to detect it. In this manuscript， a novel approach for measuring the minimal toxic dose （MTD） of premature ventricular contractions （PVC） poisoning of rats was established. Then， the determination methodology and conditions were optimized to meet the needs of the quality and biological assessment， including animal sex， weight， stability of standards and test solutions. Using this method， the MTD value of different Fuzi products were determined， such as Heishunpian， Baifupian， Zhengfupian， Baofupian， and Paotianxiong. The results showed that the MTD of Fuzi was significantly decreased after detoxification processed （P<0.05） and the MTD of Heishunpian， Zhengfupian， Baofupian and Baifupian was as much as 15.76， 22.36， 19.65 and 20.97 times to that of unprocessed Shengfuzi. In addition， Paotianxiong could not induce PVC in rats， which indicated that Paotianxiong was nontoxic and safe.This method could appropriately reflects the cardiotoxity of Fuzi and its prepared samples. Together with the chemical composition analysis， the contents of diester alkaloids were explored including aconitine， mesaconitine and hypaconitine as well as monoester alkaloids in Fuzi and its prepared products were significantly associated with PVC. Furthermore， there may be some components undetermined facilitating arrhythmia to be worth exploring. This research provides an overall and comprehensive approach to diagnose early clinical cardiotoxity and control the quality of Fuzi， which could not only be a complementary solution for the chemical evaluation， but a new method to ensure its efficacy and security of clinical application.

[Key words]Fuzi； biological assessment； cardiac toxicity； premature ventricular contractions （PVC）； minimal toxic dose； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162017

附子是確有療效的毒性中藥。以參附注射液、四逆湯為代表的附子制劑，對于各種急、慢性心衰均具有顯著療效，奠定了附子在中醫(yī)臨床的特殊地位。然而，近十多年來，東亞地區(qū)幾乎每年都有附子中毒的不良反應(yīng)報道；究其原因，多與飲片質(zhì)量密切相關(guān)^[1-2]。通過文獻(xiàn)和臨床實(shí)際調(diào)查，發(fā)現(xiàn)附子及其炮制品導(dǎo)致的不良反應(yīng)，除極個別特殊病例發(fā)生死亡，絕大部分都是飲片質(zhì)量波動引起心律失常為主的心臟毒性^[3]。附子的毒性成分主要是烏頭堿類物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的心臟毒性。附子炮制后可顯著降解劇毒的烏頭堿類成分，起到炮制減毒的效果，保障臨床應(yīng)用安全性。文獻(xiàn)研究表明，烏頭堿中毒后，在哺乳動物心電圖上依次表現(xiàn)為室性早搏、室性心動過速、心室纖顫、心室撲動以及停搏^[4-5]，其中室性早搏是烏頭堿和附子心臟毒性最早期的中毒標(biāo)志。然而，目前尚缺乏針對這一早期心臟中毒反應(yīng)的評價方法。因此，測定附子引起大鼠室性早搏的最小中毒量（MTD），可作為附子炮制品減毒程度和質(zhì)量評價的重要參考指標(biāo)。本文探索建立基于室性早搏MTD測定的附子炮制品質(zhì)量生物評價方法，通過對測定方法學(xué)的研究，明確了相關(guān)的影響因素；以此為基礎(chǔ)，評價了生附片、黑順片、白附片、蒸附片、炮天雄、刨附片的生物毒性，為附子的質(zhì)量評價與臨床應(yīng)用提供了新的思路與方法。

1 材料

1.1 藥物

黑順片、炮天雄、蒸附片、刨附片、白附片于2014年10月采購于四川江油中壩附子科技有限公司。經(jīng)中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工炮制品。

1.2 試劑

烏頭堿對照品購于成都克洛瑪生物科技有限公司，批號150322；二氯甲烷，乙酸乙酯，異丙醇，乙酸銨，濃氨，乙醇均為分析純，購于北京化工廠；去離子水（自制）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；氯化鈉注射液購于石家莊四藥有限公司，批號15111103201；烏來糖（氨基甲酸乙酯）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號No20060227。

1.3 儀器

RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；BYZ-810T注射泵（長沙比揚(yáng)醫(yī)療器械有限公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（四元泵，自動進(jìn)樣器及UV檢測器）；Gradient A10 Mill-Q 超純水器（法國 Millipore 公司）；Sartorius-BS110S千分之一分析天平、1/10萬分析天平（德國賽多利斯公司）；臺式凍干機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；超聲波清洗儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.4 動物

SD大鼠，SPF級，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK-（軍）2007-004。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法與評價指標(biāo)

2.1.1 心電圖的測定 大鼠用20%烏來糖溶液（8 mL·kg^-1）麻醉，背位固定，連接電極用多道生理信號采集處理系統(tǒng)測定二導(dǎo)聯(lián)心電圖，描記正常心電圖。注射器與頭皮針相連，一端固定于微量注射泵上，另一端接于大鼠尾靜脈中，以2 mL·h^-1恒速推注烏頭堿溶液或附子炮制品提取液，觀察并記錄心電圖的變化，直至出現(xiàn)心室早搏（PVC）的變化，即首次出現(xiàn)QRS波倒置及變寬，記錄此時的推注體積。體積越小，樣品毒性越強(qiáng)。大鼠正常心電圖與室性早搏的心電圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備^[6] 精密稱取烏頭堿對照品適量于棕色量瓶中，加無水乙醇超聲并定容，配制質(zhì)量濃度為200 mg·L-1 的對照品母液。取0.5 mL于20 mL離心管量瓶中，加生理鹽水稀釋、定容，即得質(zhì)量濃度為5 mg·L^-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取附子供試品粉末約2 g，加入70%乙醇20 mL，超聲提取30 min（功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下），離心（5 000 r·min^-1，10 min）分離上清液，加入70%乙醇定容至20 mL。將提取液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，置于通風(fēng)櫥中，待溶劑揮發(fā)至約1 mL，轉(zhuǎn)移并用生理鹽水定容至2 mL，生附子用生理鹽水定容到5 mL，即得供試品溶液。

2.1.4 MTD計算方法 對于對照品而言，出現(xiàn)室性早搏的MTD為推注烏頭堿的質(zhì)量除以大鼠的體重；對于附子飲片而言，出現(xiàn)室性早搏的MTD為推注飲片的質(zhì)量除以大鼠的體重。

2.1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；方差齊采用LSD分析，方差不齊采用Tamhane分析。

2.2 基于室性早搏中毒量測定的方法學(xué)研究^[7]

2.2.1 動物性別的選擇 取體重為（200±20）g的SD雌雄大鼠各6只，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)確稱重。以5 mg·L^-1的對照品溶液為測試液，按2.1項下方法測定烏頭堿的最小中毒量，研究動物性別對毒性的影響，結(jié)果見圖2。由圖可知，雄性動物的MTD為10.25±1.43，組內(nèi)RSD為13.95%；雌性動物的MTD為12.26±2.14，組內(nèi)RSD為17.48%；盡管經(jīng)統(tǒng)計分析，兩者結(jié)果無顯著性差異，但從RSD可看出，雄性動物的數(shù)據(jù)更集中，組內(nèi)差異更小，有利于提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，故確定雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動物。

2.2.2 動物體重的選擇 取體重分別在（200±20），（240±20），（280±20） g的SD雄性大鼠各6 只，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)確稱重。以5 mg·L^-1的對照品溶液為測試液，按2.1項下方法測定烏頭堿的最小中毒量，研究動物體重對毒性的影響，結(jié)果見圖3。由圖可知，（200±20） g動物的MTD為10.25±1.43，組內(nèi)RSD為13.95%；（240±20）g動物的MTD為11.77±3.65，組內(nèi)RSD為31.01%；（280±20）g動物的MTD為10.11±2.65，組內(nèi)RSD為26.23%，盡管經(jīng)統(tǒng)計分析，三者結(jié)果無顯著性差異，但從RSD可看出，體重在（200±20）g動物的數(shù)據(jù)更集中，組內(nèi)差異更小，有利于提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，故確定體重在（200±20）g大鼠為實(shí)驗(yàn)動物。

2.2.3 對照品儲備液穩(wěn)定性的考察 取體重在（200±20）g的SD雄性大鼠，分別在對照品溶液存放第0，3，7 天測定其最小中毒量，每組各6 只，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)確稱重。以5 mg·L^-1的對照品溶液為測試液，按2.1項下方法測定烏頭堿的最小中毒量，研究對照品儲存時間對毒性的影響，結(jié)果見圖4。由圖可知，當(dāng)天配制的對照品MTD為10.25±1.43，組內(nèi)RSD為13.95%；儲備3 d的對照品MTD為13.87±2.46，組內(nèi)RSD為17.75%；儲備7 d的對照品MTD為12.97±3.99，組內(nèi)RSD為30.80%。經(jīng)統(tǒng)計分析，儲備3，7 d的標(biāo)準(zhǔn)液與當(dāng)天配制的標(biāo)準(zhǔn)液有顯著性差異，說明標(biāo)準(zhǔn)液儲備時間越長其毒性降低。從RSD可看出，當(dāng)天配制的對照品的數(shù)據(jù)更集中，組內(nèi)差異更小，有利于提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，因此對照品臨用現(xiàn)配。

2.2.4 供試品儲備液穩(wěn)定性的考察 取體重在（200±20）g的SD雄性大鼠，分別供試品溶液存放第0，3，7天測定其最小中毒量，每組各6 只，研究供試品儲存時間對毒性的影響，結(jié)果見圖5。當(dāng)天配制的供試品MTD為2.27±0.54，組內(nèi)RSD為23.63%；儲備3 d的供試品MTD為3.88±1.11，組內(nèi)RSD為28.81%；對照品儲備7 d的MTD為4.58±1.54，組內(nèi)RSD為33.59%。經(jīng)統(tǒng)計分析，儲備3，7 d的供試品與當(dāng)天配制的供試品有顯著性差異，說明供試品儲備時間越長其毒性降低。從RSD可看出，當(dāng)天配制的供試品的數(shù)據(jù)更集中，組內(nèi)差異更小，有利于提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，因此供試品需臨用現(xiàn)配。

2.2.5 方法重現(xiàn)性 準(zhǔn)確稱取同一黑順片樣品細(xì)粉6 份，按標(biāo)準(zhǔn)化后的方法測定它們的MTD。分別為2.36，1.92，2.28，3.18，2.29，1.58 g·kg^-1，其RSD為23.63%，符合藥品質(zhì)量生物評價方法的技術(shù)要求^[8]。

2.3 不同附子的炮制品毒性測定

運(yùn)用此方法測定生附子、黑順片、蒸附片、刨附片、白附片、炮天雄的MTD，結(jié)果見圖6。生附子的毒性顯著高于其他炮制品（P<0.05），其中黑順片、蒸附片、刨附片與白附片的MTD分別是生附子的15.76，22.36，19.65，20.97倍，不同炮制的附子最小中毒劑量各不相同，但毒性存在一定差異。炮天雄檢測不出MTD，安全無毒。整體而言，除生附子外，其余飲片的毒性強(qiáng)弱順序?yàn)楹陧樒?gt;白附片>刨附片≈蒸附片>炮天雄。

3 化學(xué)評價的方法與結(jié)果

3.1 不同附子的炮制品化學(xué)成分的HPLC測定^[9-10]

對照品溶液的制備：精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿及次烏頭堿適量，加入0.05%鹽酸-甲醇溶液溶解，定容，制得質(zhì)量濃度分別為40.4，43.6，43.2，101.6，49.2，100.0 mg·L^-1的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：取附子不同炮制品，樣品粉碎，過3號篩。取粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 mL，通風(fēng)櫥中回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

色譜條件：Phenomenex Gemini C₁₈色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A相為乙腈-0.04mol·L^-1醋酸銨溶液（濃氨溶液調(diào)pH 10.0）（1∶3），B相為乙腈-0.04 mol·L^-1醋酸銨溶液（濃氨溶液調(diào)pH 10.0）（65∶35），梯度洗脫，0～20 min，10%～22% B；20～30 min，22%～37% B；30～40 min，37%～47.5% B；40～45 min， 47.5%～52% B；45～65 min， 52%～60% B；65～75 min，60%～75% B；75～80 min，75%～95% B；流速0.8 mL·min^-1；檢測波長235 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

附子酯型生物堿含量測定結(jié)果見表1。生附子的雙酯型生物堿含量遠(yuǎn)高于其他飲片，炮制后各飲片中雙酯型生物堿含量大幅降低，而部分飲片如黑順片、蒸附片等單酯型生物堿含量升高。從雙酯型生物堿含量來看，白附片略高于黑順片；但根據(jù)MTD生物測定結(jié)果來看，白附片的PVC心毒性低于黑順片；說明僅僅依據(jù)《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)衡量附子飲片的毒性還有一定的局限性，有必要對毒性成分含量與MTD的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步分析。

3.2 化學(xué)含量與MTD相關(guān)性分析

依據(jù)圖6測定的MTD數(shù)據(jù)與表1測得的生物堿含量數(shù)據(jù)，采用線性相關(guān)分析研究各成分與MTD的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)計算結(jié)果以熱圖形式表示，采用Hem I軟件作圖，見圖7。由結(jié)果可知，雙酯型生物堿含量與MTD呈明顯的負(fù)相關(guān)，單酯型生物堿對MTD的影響規(guī)律為苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿，而苯甲酰次烏頭原堿對MTD的影響微乎其微，這與上述單體成分的毒性強(qiáng)弱結(jié)果是基本一致的^[11]。上述研究提示，附子炮制品致心律失常毒性主要與雙酯型生物堿有關(guān)，同時，苯甲酰烏頭原堿的作用也不可忽略。由前期研究可知，生附子中主要是雙酯型生物堿，單酯型生物堿含量很低，加熱炮制水解后，雙酯型生物堿大量水解為單酯型生物堿，飲片中單酯型生物堿豐度很高，而雙酯型生物堿豐度很低。盡管單酯型生物堿的毒性遠(yuǎn)弱于雙酯型生物堿，但在飲片中，大量的單酯型生物堿仍對飲片的整體毒性有一定影響。這也說明，單純采用《中國藥典》的雙酯型生物堿含量之和，并不能完全代表飲片的整體毒性，而本文提供的基于大鼠室性早搏心臟毒性的附子質(zhì)量生物評價方法可作為有益補(bǔ)充。

4 討論

評價標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性對于確保飲片質(zhì)量至關(guān)重要。目前，關(guān)于附子毒性評價，主要分為化學(xué)評價與生物評價2種方法。化學(xué)評價以2015年版《中國藥典》為代表，規(guī)定黑順片、白附片中3種雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總和不超過0.02%。但該方法存在一定問題：其一，3種成分不能完全代表附子的整體毒性，還存在其他的劇毒成分，如印烏頭堿、3-乙酰烏頭堿等；其二，3種成分的毒性并不相同，次烏頭堿的毒性僅為烏頭堿的1/3，三者之和簡單相加缺乏依據(jù)^[12]。生物評價以急性毒性的改良寇氏法為代表，通過測定灌胃后動物的半數(shù)致死量LD₅₀或最大耐受量作為評價依據(jù)。但該法實(shí)驗(yàn)周期長，消耗動物量大，靈敏度也較低，很難滿足生物測定的要求^[13]。為了克服上述不足，課題組前期建立了通過大鼠尾靜脈推注附子提取液，測定最小致死量的生物毒價評價方法^[7]，并進(jìn)一步建立了基于毒性系數(shù)校正的含量測定方法——附子毒性成分指數(shù)^[14]，用于生附子的毒性評價。盡管這些方法快速準(zhǔn)確，但主要適用于泥附子或生附子的整體毒性評價，而炮制品由于毒性較低，很多樣品難以直接測出最小致死量^[15]，需要建立新的檢測更加靈敏的方法。

附子中烏頭堿類成分多而復(fù)雜，其毒性強(qiáng)弱不能一一去表征，需在整體動物上評價附子毒性強(qiáng)弱。通過文獻(xiàn)和臨床實(shí)際調(diào)查，除極個別特殊病例發(fā)生死亡，絕大部分都是飲片質(zhì)量波動以引起心律失常為主的心臟毒性。本方法在附子飲片的微毒評價中具有準(zhǔn)確性、快速性、經(jīng)濟(jì)性等技術(shù)優(yōu)勢。首先，通過測定動物出現(xiàn)室性早搏的最小中毒量，能準(zhǔn)確直觀地表征附子飲片的毒性；其次，本方法在測定過程中，大鼠一般5 min左右即出現(xiàn)室性早搏；而一般的HPLC，單樣本的測定時間在60～90 min^[10]；而傳統(tǒng)的改良寇氏法則需2周的觀察周期^[16]；本方法具有更快的檢測速度，有利于多樣本的快檢。第三，由于本方法在測定過程中僅需測定最小中毒量，動物處于輕度中毒狀態(tài)，并不死亡。而烏頭堿等成分在體內(nèi)的代謝速度較快^[17]，待麻醉劑烏來糖及附子成分代謝完畢后，動物仍可重復(fù)使用，大大降低了實(shí)驗(yàn)動物的消耗，節(jié)約了檢測成本，也更加符合實(shí)驗(yàn)動物的倫理與福利要求。此外，本方法技術(shù)難度小，無需特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備，有利于該方法的推廣應(yīng)用。

本方法的建立為附子、也可適用于川烏、草烏的早期心臟毒性評價提供了新的方法。①可用于附子配方顆粒的質(zhì)量評價；在中藥配方顆粒全面放開的條件下，如何確保免煎附子（黑順片、淡附片）配方顆粒沖服時的安全性，中藥質(zhì)量易受多種因素影響^[18]。如何快速識別評價產(chǎn)品質(zhì)量（毒性）的一致性，更顯緊迫性與必要性。②可用于不同商品等級黑順片的質(zhì)量評價；傳統(tǒng)商品規(guī)格講求辨狀論質(zhì)，黑順片以片張大、烏黑油亮為佳，但市場流通的黑順片大小、顏色差異明顯，不同等級黑順片毒性是否明顯不同，值得探究。③可用于含附子注射劑的質(zhì)量評價；注射劑靜脈給藥，較之于口服給藥，安全風(fēng)險相對較高，運(yùn)用本方法在質(zhì)檢環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)，將有助于控制藥物風(fēng)險，避免因原料質(zhì)量或工藝因素波動造成的中毒反應(yīng)。

綜上所述，本文提出的基于室性早搏中毒量測定的附子早期心臟毒性評價方法是一種關(guān)聯(lián)臨床、直觀準(zhǔn)確、快速經(jīng)濟(jì)的生物毒性評價方法，有利于確保臨床用藥的安全可靠，為附子飲片或制劑的質(zhì)量評控提供了新的研究思路與參考實(shí)例。

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[責(zé)任編輯 馬超一]