葛根素對大鼠心肌缺血再灌注損傷中Cx43的影響

姚樹青，崔成立

(包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

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葛根素對大鼠心肌缺血再灌注損傷中Cx43的影響

姚樹青，崔成立

(包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

目的：探討葛根素對大鼠心肌缺血再灌注損傷中縫隙連接蛋白43含量及分布狀況的影響。方法：72只健康SD大鼠隨機分成4組，每組18只，分別為空白對照組、實驗對照組、葛根素預處理組及葛根素后處理組。觀察各組心肌纖維的形態(tài)變化，應用免疫組化分析心肌縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)的含量及分布狀況。結(jié)果：1.與空白對照組相比，實驗對照組心肌纖維分布無序而紊亂，部分溶解甚至斷裂，心肌細胞膜上Cx43含量顯著減少(P<0.05)，分布不規(guī)律；2.與實驗對照組相比，葛根素預處理組和葛根素后處理組心肌纖維分布有明顯改善，細胞膜上Cx43含量明顯增多(P<0.05)，且分布較規(guī)律；3.葛根素預處理組和葛根素后處理組之間無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：葛根素對缺血再灌注損傷心肌具有一定保護作用，其機制可能與改善心肌細胞膜上Cx43的含量及分布有關(guān)。

心肌；缺血再灌注；葛根素；縫隙連接蛋白43

隨著人們生活水平的提高與飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，冠心病的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，心肌缺血是導致冠心病的原因之一。當心肌處于缺血狀態(tài)下，通過多種手段恢復心肌血液供應，不僅不能減輕心肌損傷程度，反而會加重缺血心肌的損傷程度，即所謂的心肌缺血再灌注損傷。縫隙連接是由一種特殊的膜蛋白通道組成，主要存在于相鄰心肌細胞間的閏盤處,具有親水性和低阻抗性,是細胞間進行物質(zhì)交換及信息傳遞的唯一途徑，而心室肌縫隙連接主要以縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)為主。大量實驗研究證實葛根素具有擴張冠狀動脈，降低血管外周阻力，增加血流量，在一定程度上具有保護心肌的作用。本實驗通過大鼠在體心肌缺血再灌注模型，觀察葛根素對損傷心肌細胞膜上Cx43含量及分布的影響，初步探討其保護機制。

1 對象與方法

1.1 主要試劑和儀器 兔抗鼠Cx43多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)；免疫組化SP試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)；葛根素(北京四平制藥有限公司，批號:15062018)；DAB顯色試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗對象及方法 72只健康SD大鼠(雌雄不限，體重220.2±30.0g，內(nèi)蒙古大學動物實驗中心提供)，隨機分為4組，每組18只。葛根素預處理組：缺血前10 min經(jīng)腹腔注射葛根素注射液，后缺血30 min，再灌注120 min；葛根素后處理組：缺血后10 min經(jīng)腹腔注射葛根素注射液，使其共缺血30 min，再灌注120 min；實驗對照組：不予藥物處理，單純?nèi)毖?0 min，再灌注120 min；空白對照組：只開胸不結(jié)扎，持續(xù)麻醉狀態(tài)150 min。10 %水合氯醛腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上，針形電極插于大鼠四肢皮下，連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，并接微型動物呼吸機。剪斷大鼠胸骨左緣第3～4軟肋，打開胸腔，剪開心包膜，用左手拇指和食指順勢將心臟擠出胸腔，于左心耳和動脈圓錐間距左心耳下緣約2 mm處穿線(6/0絲線)，進針深度約1.5 mm，結(jié)扎前在血管和結(jié)扎線之間放一軟硬適度的細塑料管后再結(jié)扎，再灌注時只需將塑料管快速拔出即可。以心電圖示ST段弓背抬高、結(jié)扎線以下心肌顏色變白作為心肌缺血標志；再灌注時以ST段逐漸回落，缺血區(qū)心肌顏色逐漸轉(zhuǎn)暗作為再灌注標志。

1.3 觀察指標

1.3.1 心肌HE染色 從每組中隨機選取3只用于心肌HE染色，實驗結(jié)束后取下心臟，將心臟置于甲醛中固定24 h后，用流水沖洗并修型、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水、蘇木素-伊紅染色、梯度酒精脫水、樹膠封片，光學顯微鏡觀察。

1.3.2 心肌Cx43免疫組化 每組大鼠15只，實驗完畢后取出心,4 %多聚甲醛固定24 h，流水沖洗后修型、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水，后按照Cx43試劑盒說明書的步驟進行實驗，DAB顯色(在顯微鏡下密切觀察著色情況，染色時間不可太長)、蘇木精復染、鹽酸酒精分化、脫水、透明至封片，待片干后顯微鏡觀察。每個標本取3張片子，每張切片中隨機選取3個視野進行拍照觀察。用Image-Pro-Plus v 7.0圖像分析系統(tǒng)檢測心肌Cx43平均光密度值(無需蘇木精復染及鹽酸酒精分化)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。Cx43光密度多組之間比較用單因素方差分析，兩組之間比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 空白對照組心肌纖維排列整齊規(guī)律，無變性壞死，心肌間質(zhì)無炎性細胞浸潤。實驗對照組心肌纖維排列紊亂，腫脹甚至部分斷裂，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。葛根素預處理組及葛根素后處理組心肌損傷的程度都較輕，心肌纖維輕度腫脹，心肌間質(zhì)可見極少數(shù)炎性細胞浸潤。

2.2 心肌Cx43免疫組化 空白對照組鏡下可見Cx43呈棕黃色帶狀及點狀物，大部分分布于心肌細胞端—端連接即閏盤處，少部分分布于細胞側(cè)—側(cè)連接處，且其走行規(guī)律，視野清晰；實驗對照組Cx43走行凌亂而分散，且其分布亦發(fā)生改變，分布于閏盤處的量明顯減少，而在細胞側(cè)—側(cè)連接處增多；葛根素預處理組和葛根素后處理組心肌細胞膜上Cx43表達量較實驗對照組明顯增多，且其分布情況更接近空白對照組。實驗對照組Cx43光密度低于空白對照組(P<0.05)；與實驗對照組相比，葛根素預處理組和葛根素后處理組Cx43光密度增高(P<0.05)；葛根素預處理組和葛根素后處理組之間Cx43光密度未見明顯差異(P>0.05)詳見表1，圖1、圖2、圖3、圖4。

表1 各組Cx43的免疫組化結(jié)果

a為與空白對照組比較P<0.05；b為與實驗對照組比較P<0.05；c為與葛根素預處理組比較P>0.05

大量實驗研究表明：心肌缺血再灌注會進一步加重心肌缺血損傷，使心功能障礙程度比急性心肌梗死更嚴重，病死率更高[1,2]。因此找到及時有效的應對措施和方法，是國內(nèi)外研究者們的共同心愿。在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制的某個環(huán)節(jié)中，可能會導致某些執(zhí)行特定功能的蛋白質(zhì)發(fā)生降解并表達異常，隨之繼發(fā)心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，從而影響心肌的正常生理功能[3]?？p隙連接蛋白43起著傳遞心肌細胞間物質(zhì)和電信號的作用，而且這種作用是其它蛋白無法取代的。心肌缺血不僅能使Cx43的表達量減少,而且還會使其分布發(fā)生改變。例如在體兔心臟的研究發(fā)現(xiàn)[4]，單純?nèi)毖?0 min可使左室心肌Cx43減少達40 %。當心肌發(fā)生急性梗死后Cx43表達量減少，且多散亂的分布于側(cè)-側(cè)連接處[5]。本實驗中得到的結(jié)果亦符合以往實驗結(jié)論，心肌缺血再灌注后，心肌纖維走行紊亂，部分心肌纖維斷裂甚至溶解，心肌細胞膜上的Cx43含量減少，其分布發(fā)生改變且不規(guī)則。無論是缺血前給葛根素還是缺血后給葛根素，都能夠使心肌纖維走行變得規(guī)律，心肌細胞膜上Cx43的含量增多，Cx43的分布變得規(guī)律。由此可說明葛根素對缺血再灌注損傷心肌具有一定的保護作用，其機制可能與改善心肌細胞膜上Cx43的含量及分布有關(guān)，但詳細機制還有待進一步研究探索。

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[3] 李輝，石涵，朱天民，等.紅豆杉多糖對犬心肌缺血再灌注損傷模型心肌組織損傷及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(1)：219-223.

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崔成立

2016-04-05)