胃癌病變中Runx3基因甲基化與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

李 雪， 郭春林

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

?

胃癌病變中Runx3基因甲基化與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

李 雪， 郭春林

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

目的:研究幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染、抑癌基因Runx3基因5′-CpG島甲基化與胃癌的相關(guān)性。方法:收集2014年3月至2015年9月包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診及住院患者56例經(jīng)胃鏡及病理確診為胃癌者，70例對(duì)照組選自同期該院消化內(nèi)科經(jīng)胃鏡及病理診為慢性淺表性胃炎患者。所有受檢者行胃鏡前均行C13尿素呼氣試驗(yàn)檢測(cè)Hp感染情況。采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)胃癌組及對(duì)照組中Runx3基因的甲基化狀態(tài)。結(jié)果:胃癌組Runx3基因甲基化率(53.6 %，30/56)高于對(duì)照組(7.1 %，5/70)(P<0.05)。胃癌組與對(duì)照組Hp感染差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hp陽(yáng)性胃癌組與Hp陰性胃癌組比較,Runx3基因甲基化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:Runx3基因甲基化與胃癌發(fā)生有關(guān)，幽門螺桿菌感染增加抑癌基因Runx3基因5′CpG島出現(xiàn)甲基化，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。

胃癌；甲基化；幽門螺桿菌；Runx3基因

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,其死亡率居全球腫瘤相關(guān)死亡的第2位。脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)甲基化是目前表觀遺傳修飾形式的研究熱點(diǎn)。胃癌的發(fā)生與幽門螺桿(helicobacterpylori，Hp)感染關(guān)系密切，Hp感染是致癌因子中最重要的因素。Hp感染可能導(dǎo)致Runx3基因甲基化,使抑癌基因Runx3表達(dá)缺失而導(dǎo)致胃癌發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)旨在探討胃癌組與對(duì)照組之間的關(guān)系，及其Hp感染與胃癌病變中Runx3基因甲基化的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 對(duì)象 56例胃癌組織為我院2014年3月至2015年9月經(jīng)胃鏡檢查及病理確診者，男性32例,女性24例,年齡24～69歲,平均年齡49.0歲；對(duì)照組為同時(shí)間內(nèi)收集的慢性淺表性胃炎標(biāo)本70例,男性40例,女性30例,平均年齡49.0歲。標(biāo)本收集后立即保存到-80℃冰箱中。

1.1.2 試劑 組織基因組DNA提取試劑盒、甲基化DNA檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 引物 Runx3甲基化引物:5′-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3′和5′-AAAACGACCGACGCGA ACGCCTCC-3′；Runx3非甲基化引物:5′-TTATGAGGGGTGGT TGTATGTGGG-3′和5′-AAAACAACCAACACAAACACCTCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 Hp檢測(cè) 56例胃癌組患者及70例對(duì)照組(近兩周內(nèi)均未服用過抗生素、鉍劑、質(zhì)子泵抑制劑等)檢查前均行C13尿素呼氣試驗(yàn)，空腹服用C13膠囊20 min后吹氣留樣，將專用的呼氣卡放入同位素質(zhì)譜儀內(nèi)，全程診斷過程約45 min。此法是目前國(guó)際上公認(rèn)的Hp檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有無交叉感染、無痛苦、無損傷和操作方便的優(yōu)點(diǎn)。通過口服C13尿素膠囊進(jìn)入胃部，如果有Hp，其會(huì)分解尿素酶進(jìn)而水解尿素，尿素進(jìn)一步被水解形成CO2從肺部以氣體呼出，檢測(cè)專用的呼氣卡中是否有C13，如果有則表示存在Hp。診斷標(biāo)準(zhǔn)：DOB值>4.4為Hp陽(yáng)性，DOB值<3.6為Hp陰性。

1.2.2 組織DNA提取 取30 mg凍存組織徹底研磨后，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取，并置于-20 ℃冰箱暫存。

1.2.3 甲基化檢測(cè) 按照甲基化檢測(cè)試劑盒的說明對(duì)所提取的DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理，把未甲基化的C轉(zhuǎn)化成U，U再在后續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)中變成T。經(jīng)甲基化修飾后的DNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。隨后進(jìn)行引物特異性的PCR，PCR總反應(yīng)體系為25μL:DNA1 μL,10×Buffer 2.5 μL,氯化鎂2.5 mmol/L,引物0.5 mmol/L,dNTP2.0 μL, Hotstar Taq0.3 μL，滅菌雙蒸水16.2 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,55 ℃ 35 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每次PCR均設(shè)陰性對(duì)照,用滅菌雙蒸水代替DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。之后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在配好的2 %的瓊脂糖凝膠上電泳，并在紫外線燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp感染 56例胃癌組患者中Hp陽(yáng)性38例(67.9 %)，陰性18例(32.1 %),70例慢性淺表性胃炎患者中Hp陽(yáng)性14例(20.0 %),陰性56例(80.0 %)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Runx3基因甲基化 56例胃癌組中有30例甲基化陽(yáng)性(53.6 %)，對(duì)照組70例胃粘膜中5例甲基化陽(yáng)性，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Hp、Runx3基因甲基化與胃癌的關(guān)系 38例Hp陽(yáng)性胃癌患者中,Runx3基因甲基化18例(47.3 %),無甲基化20例(52.6 %)；18例Hp陰性胃癌患者中,Runx3基因甲基化3例(16.7%),無甲基化15例(83.3 %)(圖2)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種復(fù)雜因素引起的，其中導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一就是抑癌基因失活。幽門螺旋桿菌是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要因素，已經(jīng)得到公認(rèn)，但是具體導(dǎo)致胃癌的分子機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為Hp本身并不分泌致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期幽門螺桿菌感染可能導(dǎo)致胃粘膜的萎縮、腸化生、異型增生，可能導(dǎo)致胃癌發(fā)生。Runx3是近些年發(fā)現(xiàn)的新型抑癌基因，與胃粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)分化關(guān)系密切，正常組織細(xì)胞分化被抑制，生長(zhǎng)凋亡平衡失調(diào)，可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。抑癌基因Runx3位于人染色體1號(hào)短臂1p36.1，在人體內(nèi)廣泛存在其蛋白表達(dá)，一旦染色體1p36.1的蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常，RUNX3基因表達(dá)缺失或失活可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在人類腫瘤中幾乎都存在CpG島過甲基化的現(xiàn)象。Lvanon D等[1]發(fā)現(xiàn)，胃癌早期病變中Runx3基因表達(dá)下調(diào)約達(dá)40 %，而胃癌中晚期Runx3下調(diào)達(dá)90 %。Waki等[]研究胃癌患者術(shù)后病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中有45 %的Runx3基因發(fā)生了甲基化，癌旁正常組織中有8 %。對(duì)胃癌組織中Runx3基因編碼區(qū)突變進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Runx3基因變答缺失是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的主要原因之一。Zou等[3]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織標(biāo)本中Runx3基因甲基化水平呈遞增水平，而在正常胃黏膜標(biāo)本中無RUNX3甲基化。張海元等[4]在對(duì)肝癌患者血漿中Runx3基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝細(xì)胞癌的早期診斷也有重要價(jià)值。唐國(guó)華等[5]免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Runx3表達(dá)缺失或減少為74.0 %(111/150)，PS法檢測(cè)胃癌Runx3基因甲基化為10.7 %，表明胃癌病變中DNA甲基化與Runx3基因的功能狀態(tài)之間存在相關(guān)性。Hp感染是胃癌發(fā)生的重要因素，本研究表明胃癌組中Hp感染率高于對(duì)照組。本研究胃癌組與對(duì)照組Runx3甲基化率分別為53.6 %(30/56)和7.1 %(5/70)，胃癌組織中Runx3基因的表達(dá)量高于對(duì)照組,且Runx3基因的高表達(dá)與幽門螺桿菌有關(guān)，得出幽門螺桿菌感染可能誘使Runx3基因甲基化,從而導(dǎo)致抑癌基因Runx3失去活，導(dǎo)致胃癌發(fā)生。

本研究結(jié)果表明,胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中Runx3基因甲基化可能是關(guān)鍵的早期事件,可作為胃癌早期發(fā)現(xiàn)及診治的重要參考因素，也可作為胃癌易感人群篩查的新型分子標(biāo)記和胃癌早期診斷和基因治療的靶點(diǎn),為胃癌的發(fā)現(xiàn)和診治提供依據(jù)。應(yīng)用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮唑-2-脫氧胞苷與組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌A的協(xié)同作用誘導(dǎo)去甲基化，使失活的抑癌基因甲基化逆轉(zhuǎn)從而達(dá)到治療胃癌的目的，從而改善預(yù)后及延緩胃癌的進(jìn)展。腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移通過檢測(cè)抑癌基因甲基化可能作為胃癌早期診斷和控制胃癌的發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，復(fù)雜的腫瘤病因和表觀遺傳學(xué)之間的復(fù)雜關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。隨著科學(xué)研究不斷進(jìn)步，一定會(huì)為腫瘤的診治開辟新的理論和實(shí)踐道路。

[1] 劉九思,王夢(mèng)龍.胃癌中Runx3表達(dá)及其甲基化[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,49(2):103-105.

[2] 何小兵,張海元.胃癌及癌旁組織中Runx3基因甲基化研究及臨床意義[J].吉林醫(yī)學(xué),2012,33(2):227-228.

[3] 黃定鵬,趙亞剛.RUNX3啟動(dòng)子甲基化與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,26(4):320-322.

[4] 張海元,趙薇,班靜.血漿Runx3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)診斷早期肝細(xì)胞癌的臨床價(jià)值[J].山東醫(yī)藥,2009,49(5):76-77.

[5] 唐國(guó)華,趙強(qiáng),賀修勝,等.Runx3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化對(duì)胃組織癌變影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(14):1069-1073.

Correlation of Runx3 gene methylation and helicobacter pylori infection with gastric cancer

LI Xue, GUO Chunlin

(BaotouMedicalCollege, 014040Baotou,China)

Objective:To research the correlation of helicobacter pylori (Hp) infection and methylation in the 5'CpG island of Runx3 tumor suppressor gene with gastric cancer. Methods：56 cases of gastric cancer patients diagnosed and confirmed by endoscopy and pathology in Gastroenterology Department of the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College from March 2014 to September 2015 were selected as gastric cancer group. 70 cases of chronic superficial gastritis patients during the same period in the hospital were selected as control group. C13 urea breath test was adopted to test Hp infection of all subjects prior to gastroscope. Methylation status of Runx3 gene was detected in the gastric cancer group and control group by Methylation-specific PCR (MSP). Results：Runx3 gene methylation rate in the gastric cancer group (53.6 %, 30/56) was higher than that in the control group (7.1 %, 5/70) and the difference was statistically significant (P<0. 05). There was significant difference in helicobacter pylori infection between the gastric cancer group and the control group (P<0.05). There was significant difference in Runx3 gene methylation between Hp-negative gastric cancer group and Hp-positive gastric cancer group (P<0.05). Conclusion：Runx3 gene methylation may be related to the incidence of gastric cancer. Helicobacter pylori infection increases the methylation of 5'CpG island of Runx3 tumor suppressor gene, leading to gastric cancer.

Gastric cancer; Methylation; Helicobacter pylori; Runx3 gene

郭春林

2016-03-04)