兩種消化時間對成纖維細胞體外培養(yǎng)的影響

韓苗苗，閆旭龍，文 榮

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

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兩種消化時間對成纖維細胞體外培養(yǎng)的影響

韓苗苗1，閆旭龍2，文 榮1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

目的：通過對比不同消化時間對成纖維細胞原代培養(yǎng)的影響，探索一種更為簡便、可靠的實驗方法，為原代心肌成纖維細胞的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。方法：使用Ⅱ型膠原酶多次消化法，采用兩種不同的消化時間對乳鼠心肌組織進行消化，利用差速貼壁法分離心肌細胞及心肌成纖維細胞，37 ℃孵育，使用臺盼蘭染色、免疫組化、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]等方法分析其形態(tài)、純度、增殖能力。結(jié)果：消化時間8 min組的細胞總存活率為(94.7±0.6)%，10 min組為(93.9±0.8)%，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；心肌成纖維細胞存活率8 min組為(55.3±9.0)%，10 min組為(91.8±5.5)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；波形蛋白免疫組化，兩組陽性細胞率均>95 %,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；增殖能力8min組為(5.33±0.80)，10 min組為(61.15±5.20)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：兩種消化時間獲得的心肌成纖維細胞在形態(tài)上、純度上無明顯差異，在增殖能力和心肌成纖維細胞數(shù)量上，10 min組優(yōu)于8min組。

心肌成纖維細胞；消化時間；免疫組化

心肌成纖維細胞在心臟中是除心肌細胞外的主要細胞，約占心細胞總數(shù)的2/3，廣泛存在于心肌細胞周圍，作為橋梁連接心肌細胞，輔助其發(fā)揮作用，并參與多種病理過程，如心肌重塑、炎癥、心肌梗死等，其中最嚴重的莫過于心肌纖維化。心肌纖維化是多種心肌疾病的終末階段，一旦發(fā)生即不可逆轉(zhuǎn)，嚴重影響人的生活質(zhì)量與壽命，因此，對于心肌纖維化的研究越來越受到重視。在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，心肌成纖維細胞發(fā)揮著主要病理作用。要精準(zhǔn)高效地研究心肌纖維化的發(fā)展機制及相關(guān)信號通路，獲得量大、純度高、活力佳的心肌成纖維細胞是關(guān)鍵一步。但原代心肌成纖維細胞的體外培養(yǎng)仍存在純度不高、消化不全、傳代后細胞質(zhì)量不高等問題。本實驗應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作為刺激條件[1]，對比了不同消化時間對心肌成纖維細胞體外培養(yǎng)的影響，目的在于探索一種更為簡便、可靠的實驗方法，為心肌成纖維細胞的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 出生1～3 d的Wistar大鼠，清潔級，由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心提供[合格證編號:csxk(蒙)2002-0001]。

1.2 主要試劑 AngⅡ(Sigma)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰酶(碧云天生物技術(shù)公司)、MTT試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、小鼠抗波形蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)、通用型SP免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗步驟 分別將20 mL含20 %胎牛血清培養(yǎng)基標(biāo)記為8 min組與10 min組。在無菌操作臺內(nèi)，將1只乳鼠(性別不限)用75 %的酒精活體消毒，剪開乳鼠胸部皮膚及胸廓，暴露并剪下心，迅速置于裝有無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，排出積血，剪掉上面1/3部分。再將此心移入下一個盛有無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，如此清洗3次，將心內(nèi)殘留的血洗凈。隨后將該心放入無菌小燒杯中，用無菌剪刀快速剪成約1 mm3并加入5 mL膠原酶Ⅱ洗滌后，將3 mL新的膠原酶Ⅱ與剪碎的乳鼠心肌組織塊充分混合并消化，將1/2心肌組織塊置于37 ℃水浴鍋中消化8 min(8 min組)，另1/2置于同等條件的37 ℃水浴鍋中消化10 min(10 min組)，然后棄去膠原酶Ⅱ，分別向心肌組織塊中加入5 mL新的膠原酶Ⅱ，置于37 ℃水浴鍋中再分別消化8 min、10 min，此時膠原酶Ⅱ中已含有大量被消化下來的心肌細胞與心肌成纖維細胞；收集細胞后，分別向心肌組織塊中加入5 mL新的膠原酶Ⅱ，置于37 ℃水浴鍋中再分別消化8 min、10 min，再次收集細胞；共收集6次含細胞的膠原酶Ⅱ，此時玻璃管中的心肌組織塊已呈白色絮狀。分別將8 min組與10 min組含細胞的膠原酶Ⅱ在常溫下800轉(zhuǎn)離心5 min，小心棄掉上清液，向兩沉淀物中分別加入10 mL含10 %胎牛血清的DMEM(H)培養(yǎng)基并使之變成懸濁液，用300目濾網(wǎng)將懸濁液過濾。制備細胞爬片(差速貼壁法)：取一個24孔板，向每個孔中各加一個預(yù)先泡酸并高壓滅菌的小蓋玻片，分別向其中12個孔內(nèi)加入8 min組的細胞懸濁液，另12個孔加入10 min組的細胞懸濁液，將此24孔板置于37 ℃孵箱中孵育70 min后置于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)此時大部分細胞已貼壁。因心肌細胞貼壁需要時間較長，考慮此時貼壁的大部分是心肌成纖維細胞。將24孔板放于超凈臺內(nèi)輕輕晃動，將孔內(nèi)未貼壁的心肌細胞懸液吸出，并用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基輕輕洗2遍，然后每孔內(nèi)均加入1 mL含10 % FBS的DMEM(H)培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37 ℃孵箱中孵育，原代心肌成纖維細胞的細胞爬片制備完畢。24孔板中絕大部分細胞均為心肌成纖維細胞。

1.4 鑒定細胞成活率 用300目濾網(wǎng)將細胞懸濁液過濾后，分別取900 μL細胞懸濁液置于EP管中，分別加入100 μL 0.4 %臺盼藍染液，混勻后室溫靜置3～5 min，吸取10 μL充入計數(shù)板內(nèi)，在倒置顯微鏡下觀察，正常活細胞為折光性強的圓形細胞，死亡細胞被染成藍色，取3次計數(shù)的平均值計算總細胞存活率。總細胞成活率(%)=[(總細胞數(shù)-染色細胞數(shù))/總細胞數(shù)]×100 %。心肌成纖維細胞的成活率：差速貼壁結(jié)束后，將原代心肌成纖維細胞置于37 ℃孵箱培養(yǎng)，72 h后兩組分別隨機選一個孔的細胞，不清洗直接放入胰淀粉酶消化，將已經(jīng)貼壁的細胞消化成細胞懸液，取900 μL細胞懸液置于EP管中，加入100μL 0.4 %臺盼藍染液，其它步驟同總細胞存活率。

1.5 HE染色鑒定心肌成纖維細胞的形態(tài) 將原代心肌成纖維細胞爬片放入孵箱孵育48 h，兩組分別進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。于超凈臺內(nèi)將細胞爬片分別用磷酸鹽緩沖液洗兩次，經(jīng)4 %多聚甲醛固定30 min，再磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min，用濾紙吸干剩余磷酸鹽緩沖液。加入適量蘇木素染色液，室溫靜置30 min，蒸餾水沖洗10 min，浸入95 %乙醇5 s，用濾紙吸干乙醇，加入伊紅染色液，室溫染色30 min。70 %乙醇洗2次，用濾紙吸干乙醇，室溫晾干。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.6 免疫組化鑒定心肌成纖維細胞的純度 將原代心肌成纖維細胞爬片放入孵箱孵育48 h后，兩組分別于無菌超凈臺取出爬片，經(jīng)4 %多聚甲醛固定，0.1 %triton 100室溫孵育穿透，30 %過氧化氫室溫浸泡，滴加5 % BSA封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的一抗(抗Vimentin抗體或抗α-actin抗體)，于4 ℃過夜；滴加二抗(生物素化山羊抗鼠IgG)、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色，控制反應(yīng)時間，經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.7 鑒定心肌成纖維細胞的增殖能力 將300目濾網(wǎng)過濾后的細胞懸液放置70 min后在無菌超凈臺內(nèi)吸出液體及漂浮的死細胞，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基輕輕洗2遍，分別加入5 mL含10 % FBS的DMEM(H)培養(yǎng)基，置于37 ℃孵箱中孵育48 h待培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞80 %融合后，將其分別接種于2個96孔板，24 h后加入AngⅡ，37 ℃孵育24 h，每孔依次加入10 μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]染色液，4 h后每孔中分別加入150 μL二甲基亞砜置于搖床15～30 min，待結(jié)晶溶解，于490 nm波長測定細胞吸光度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總細胞成活率與原代心肌成纖維細胞成活率 8 min組與10 min組相比，差速貼壁前兩組總的細胞存活率均大于93 %，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。差速貼壁48～72 h后，10 min組原代心肌成纖維細胞達80 %～90 %融合，8 min組原代成纖維細胞只有60 %～70 %融合，10 min組優(yōu)于8 min組(P<0.05)。見表1。

表1 兩種消化時間總的細胞存活率及原代成纖維細胞成活率對比

2.2 原代心肌成纖維細胞形態(tài) 原代心肌成纖維細胞在貼壁初期均呈圓形，折光性強，懸浮于培養(yǎng)基中，70 min后，大部分心肌成纖維細胞均已貼壁，只有少量的變?yōu)樾∷笮魏腿切危?4 h后，心肌成纖維細胞都變?yōu)槿切位蜷L梭形，較大，排列緊密，胞漿透明，細胞核呈近圓形，細胞無自發(fā)搏動。蘇木素-伊紅染色后可見原代心肌成纖維細胞胞體較大，呈長梭形，細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈淡紅色，核膜較為清晰，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，見圖1a，圖1b。原代心肌細胞細胞多為多角形，伸出偽足，核呈藍色，細胞質(zhì)呈淡紅色，核膜清晰，見圖1c。兩種消化時間得到的心肌成纖維細胞在形態(tài)學(xué)上無明顯差異。

圖1a：消化時間為8 min的原代心肌成纖維細胞HE染色(400×)；圖1b：消化時間為10 min的原代心肌成纖維細胞HE染色(400×)；圖1c：消化時間為8 min的原代心肌細胞蘇木素-伊紅染色(100×)2.3 心肌成纖維細胞的純度 原代心肌成纖維細胞中Vimentin抗原表達呈陽性，細胞質(zhì)呈棕黃色，胞核呈藍色，見圖2a、圖2b。在原代心肌成纖維細胞中，心肌細胞的標(biāo)志性抗原表達為陰性，細胞質(zhì)未被染色，細胞核呈藍色，見圖2c。8 min組與10 min組培養(yǎng)的陽性細胞率均>95 %。

圖2a：消化時間為8 min的原代心肌成纖維細胞(400×)；圖2b：消化時間為10 min的原代心肌成纖維細胞(400×)；圖2c：消化時間為8 min的原代心肌成纖維細胞(400×)2.4 心肌成纖維細胞的增殖能力 傳代過程中8 min組心肌成纖維細胞大量死亡，增殖率低；10 min組的心肌成纖維細胞的增殖快，增殖能力高于8 min組(P<0.05)。

3 討論

目前對于原代心肌成纖維細胞的研究日益增多，而原代心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法繁雜多樣，各有特點。我們探討了兩種不同的消化時間對于原代心肌成纖維細胞的影響。分離原代心肌成纖維細胞的方法多采用酶消化法[2]，在消化酶的應(yīng)用上，可使用單一胰酶消化[3]，也可用胰蛋白酶(0.05 %)加膠原酶(0.1 %)共同消化[4]。在用于消化心肌細胞的膠原蛋白酶中，Ⅱ型最常用，可分次消化，也可過夜消化。由于心組織中含有很多膠原，使用膠原酶對細胞間的膠原纖維具有很好的消化作用，而且作用緩和，對細胞損傷小，所以本實驗采用單純膠原酶Ⅱ消化法。傳統(tǒng)差速貼壁時間多為60～90 min[5]，60 min得到的心肌成纖維細胞量少，而80 min、90 min得到的心肌成纖維細胞純度差，摻雜了大量的心肌細胞，因此本實驗采用70 min差速貼壁，得到了量更多、純度更高的心肌成纖維細胞。

本實驗通過對比兩種不同的消化時間對于原代心肌成纖維細胞的影響，發(fā)現(xiàn)兩種消化時間培養(yǎng)的細胞在形態(tài)、純度方面無明顯差異，但在存活率與增殖能力方面有差異，探索出一套簡便易行、產(chǎn)量大、純度高、傳代后質(zhì)量高的原代心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法。

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Comparison between the influence of two kinds of digestion time on the in vitro culture of fibroblasts

HAN Miaomiao1,YAN Xulong2,WEN Rong1

(1.BaotouMedicalCollege,Baotou014030,China2.DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege)

Objective:To explore a simpler and more reliable experimental method, providing the basis for basic research of primary cultured cardiac fibroblasts by comparing the influence of different digestion time on the primary culture of fibroblasts. Methods:Type II collagenase was used to digest for many times and two different kinds of digestion time were used to digest the cardiac tissues of neonatal rats. The cardiomyocytes and cardifibroblasts were isolated by differential adhesion and were incubated at 37 ℃. Trypan blue staining, immunohistochemistry, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) etc. were used to analyze the morphology, purity and proliferation.Results:There was no significant difference between the survival rate of the two kinds of digestion time [8min (94.7±0.6)%，10min (93.9±0.8)% ]. The difference between the number of fibroblasts [(8min 55±9.0，10min 91±5.5)] was significant. In terms of vimentin immunohistochemical results, the positive rates of the two groups were both higher than 95 %. The proliferation of the 10 min group (61.15±5.20)was significant, but there was no significant change in the 8 min group.Conclusion：There is no difference in the shape or in the purity of fibroblasts between the two groups. But in terms of the ability to proliferate, the 10 min group is better than that of the controlled group . Besides , the 10min group can get more cardiac fibroblasts.

Cardiac fibroblast; Digestion time; Immunohistochemistry

閆旭龍

2016-03-04)