鹿源大腸桿菌ESBLs基因型檢測與分析

馮 濤 王曉菲 劉偉石 薛 原

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

鹿源大腸桿菌ESBLs基因型檢測與分析

馮 濤 王曉菲 劉偉石 薛 原*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

ESBLs；

(College of Wildlife Resources，Northeast Forest University，Harbin ，150040，China)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)的能使細(xì)菌對三代頭孢菌素類、單酰胺類及青霉素類耐藥的一類酶，可在菌株間轉(zhuǎn)移或傳播。由于編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因多數(shù)存在于細(xì)菌體內(nèi)可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，使得耐藥基因可以在細(xì)菌之間通過接合和轉(zhuǎn)化等方式進(jìn)行水平傳播，導(dǎo)致耐藥菌的廣泛傳播，嚴(yán)重影響了β-內(nèi)酰胺類抗生素的治療效果，成為獸醫(yī)臨床面臨的嚴(yán)重問題[1]。ESBLs細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒可能帶有對喹諾酮、氨基糖苷類和磺胺類等藥物的多種耐藥基因，使其具有多重耐藥表型，嚴(yán)重影響臨床治療的效果。

ESBLs根據(jù)基因同源性的不同，目前可分為5類：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他類型等[2-3]。本研究旨在對東北地區(qū)臨床分離的150株鹿源大腸桿菌進(jìn)行ESBLs 產(chǎn)生情況及基因型檢測，這將有助于明確菌株耐藥基因潛在的播散趨勢，有效監(jiān)控細(xì)菌耐藥性。調(diào)查東北地區(qū)鹿源大腸桿菌ESBLs 流行基因型，為闡明鹿源大腸桿菌耐藥與產(chǎn)酶關(guān)系奠定基礎(chǔ)，并為指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

質(zhì)控菌：大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；臨床菌株：來源于東北地區(qū)的養(yǎng)鹿場。

1.2 藥品

氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻吩(KF)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、阿莫西林/棒酸(AMC)、亞胺培南(IPM)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(CN)、卡那霉素(K)、新霉素(NEO)、阿米卡星(AK)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFX)、四環(huán)素(TE)、強(qiáng)力霉素(DO)、氯霉素(C)、復(fù)方新諾明(SXT)、多粘菌素B(PB)，購自杭州天和微生物試劑有限公司；頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)和頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 主要儀器和試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA 片段凝膠回收試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DL5000 DNAladder、taq酶大連寶生物工程有限公產(chǎn)品；DYY-12型多用電泳儀、水平微型電泳槽，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成相分析系統(tǒng)，美國Alpha Imager 2200公司產(chǎn)品；YEAR 2000 PCR儀，德國Biometra公司產(chǎn)品；3K30 高速冷凍離心機(jī)，美國SIGMA 公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 ESBLs檢測

按CLSI標(biāo)準(zhǔn)(抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn))操作和判斷。采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

2.2 ESBLs確證實(shí)驗(yàn)

2.2.1 初步篩選實(shí)驗(yàn)

可悲的是，當(dāng)一個人如日中天的時候，誰會去想居安思危？“安”的時候不會想到“?！?，“安”的時候也不相信有“危”。三十年河?xùn)|三十年河西，就是對不懂得居安思危的人的懲罰。

以紙片擴(kuò)散法對受試菌抗藥性進(jìn)行初篩試驗(yàn)，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)CAZ≤22 mm，CRO ≤25 mm，CTX≤27 mm，ATM≤27 mm者為產(chǎn)生ESBLs。以大腸桿菌ATCC25922作陰性對照。

2.2.2 表型確證試驗(yàn)

將受試菌均勻涂布于M-H 瓊脂平板，貼CAZ、CAZ/Clav 和CTX、CTX/Clav 兩組紙片，37℃培養(yǎng)16 h，如兩組中任一組加克拉維酸比不加克拉維酸抑菌圈直徑≥5 mm，可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs 菌株。

2.3 ESBLs 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析比較

2.3.1 引物的設(shè)計與合成

按照參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計合成引物，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。CTX-M產(chǎn)物長度為905 bp，TEM產(chǎn)物長度為717 bp，SHV產(chǎn)物長度為593 bp，OXA產(chǎn)物長度為198 bp。

2.3.2 PCR擴(kuò)增模板的制備

將150 株鹿源大腸桿菌接種于的LB 瓊脂平板過夜培養(yǎng)后，挑取單個菌落接種于LB 肉湯中，37℃搖床培育12 h，用按吸附柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明提取質(zhì)粒DNA。

2.3.3 不同型別ESBLs基因的PCR檢測

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，退火1 min，退火溫度56.5℃，72℃延伸1 min，從第二步開始共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。

3 結(jié)果

3.1 ESBLs檢測結(jié)果

各藥對質(zhì)控菌的抑菌圈均符合CISI 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。150株鹿大腸桿菌ESBLs檢測結(jié)果表明，在初篩試驗(yàn)中，有84株大腸桿菌檢測為疑似產(chǎn)ESBLs 菌株。經(jīng)確證試驗(yàn)，84株疑似菌株中均為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為56%(84/150)。

3.2 SHV、CTX-M、TEM 、OXA基因的檢測結(jié)果

以150株臨床分離的鹿源大腸桿菌的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行SHV、CTX-M、TEM、OXA基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHV、CTX-M、TEM、OXA擴(kuò)增均為陽性，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段相符(圖1、2、3、4)。TEM基因PCR擴(kuò)增陽性例數(shù)為35例，陽性率為23.33%；CTX-M基因檢出的陽性例數(shù)為5例，陽性率為3.33%；SHV基因檢出的陽性例數(shù)為38例，陽性率為25.33%；OXA基因檢出的陽性例數(shù)為12例，陽性率為8%。

圖1 CTX-M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果A-F CTX-M基因 Marker 2kbFig.1 PCR amplification product of CTX-M gene

圖2 TEM基因PCR擴(kuò)增結(jié)果A-F TEM基因 Marker 2kbFig.2 PCR amplification product of TEM gene

圖3 SHV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果A-F SHV基因 Marker 5kbFig.3 PCR amplification product of SHV gene

圖4 OXA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果A-E OXA基因 Marker 5kbFig.4 PCR amplification product of OXA gene

3.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同藥物對150株鹿大腸桿菌耐藥率見圖5。84株產(chǎn)酶菌的耐藥率均比66株不產(chǎn)酶菌高。

圖5 150 株鹿源大腸桿菌對抗菌藥的藥敏試驗(yàn)及耐藥率Fig.4 Antibiotic susceptibility and resistance rates of 150 Escherichia coli strains against agents

4 討論

ESBLs 現(xiàn)已成為介導(dǎo)革蘭陰性桿菌對新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制，造成了臨床治療上的很大困難[5]。大腸桿菌則是產(chǎn)ESBLs的主代表菌株。本試驗(yàn)對150 株臨床分離鹿源大腸桿菌進(jìn)行ESBLs檢測采用的是CLSI 推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。共檢出84株為產(chǎn)ESBLs 菌，陽性率為56 %。由于臨床β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的大量應(yīng)用及不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株廣泛傳播，尤其產(chǎn)ESBLs 菌引起的耐藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重[6]。ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，易在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌間傳遞造成暴發(fā)流行，給臨床治療帶來眾多問題。ESBLs 廣泛分布于大腸桿菌中，以其水解底物譜廣、耐藥性強(qiáng)、易傳播等特點(diǎn)受到當(dāng)今各國的普遍關(guān)注。產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌呈世界性流行，不同地區(qū)流行的基因型不同。Livermore等[7]發(fā)現(xiàn)歐洲各國產(chǎn)ESBLs耐藥菌的類型從以TEM、SHV 型變?yōu)橐訡TX-M型為主。

SHV型基因主要位于克雷伯菌中，并不是我國大腸桿菌主要的ESBLs型別[8]。本研究中PCR結(jié)果顯示，150株鹿源大腸桿菌中SHV型擴(kuò)增陽性率為25.33%，是東北地區(qū)主要的β-內(nèi)酰胺酶型別。國內(nèi)也有檢出報道，例如上海復(fù)旦大學(xué)的熊自忠等和北京醫(yī)院的胡云建等分別在2株和1株大腸桿菌中檢測到SHV-12型ESBLs。應(yīng)加強(qiáng)對養(yǎng)殖場鹿感染菌株耐藥性監(jiān)測，研究耐藥基因分子流行病學(xué)規(guī)律。

[1] 許桂芳，金春光.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌耐藥性及基因同源性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(8)：1843-1844.

[2] 胡同平，張文蘭，張永梅.大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶株的基因型研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19(17)：2239-2241.

[3] 許穎，李曉慶，江俊等.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因分型研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2009，30(9)：1363-1365.

[4] Van T T H，Chin J，Chapman T，et al.Safety of raw meat and shellfish in Vietnam：an analysis ofEscherichiacoliisolations for antibiotic resistance and virulence genes[J].International Journal of Food Microbiology，2008，124(3)：217-223.

[5] Yan J J，Ko W C，Tsai S H，et al.Dissemination of CTX-M-3and CMY-2β-lactamases among clinical isolates ofEscherichiacoliin southern Taiwan[J].Journal of Clinical Microbiology，2000，38(12)：4320-4325.

[6] Rupp M E，F(xiàn)ey P D.Extended spectrum beat-lactamase(ESBL)producing enterobacteriaceae considerations for diagnosis，prevention and drug treatment[J].Drugs，2003，64(4)：353-365.

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[8] Zong Z，Lü X，Valenzuela J K，et al.An outbreak of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiproducing OXA-23 carbapenemase in western China[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2008，31(1)：50-54.

ESBLs；

Detection of Extended-Spectrum β-Lactamases Genotypeand Antibiotic Resistance Analysis Among Escherichia coli Isolates from Sika Deer in Northeast China

Feng Tao Wang Xiaofei Liu Weishi Xue Yuan*

To detect genotypes of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)in pathogenic enterobacteria cases and guide the use of veterinary drugs，we amplified ESBL genotypes by polymerase chain reaction(PCR)and sequenced and analyzed them.Eighty-four ESBL-positiveEscherichiacolistrains were isolated from sika deer and analyzed for antibiotic resistance.Four different genotypes were detected among these ESBL positive isolates by PCR.The positive rates of TEM，CTX-M，SHV and OXA were 23.33%，3.33%，25.33%，and 8%，respectively.The results showed that the multi-resistance rate among ESBL-positive strains was higher than that of the ESBL-negative strains.

稿件運(yùn)行過程

2016-04-25

修回日期：2016-05-31

發(fā)表日期：2016-11-10

大腸桿菌；

TEM 基因；

SHV基因；

CTX-M基因；

OXA基因

Escherichiacoli；

TEM gene；

SHV gene；

CTX-M gene；

OXA gene

Q959 R446.5

A

2310-1490(2016)04-321-04

采用K-B法檢測150株黑龍江、吉林、遼寧的鹿源大腸桿菌對20種抗菌藥物的耐藥性，了解耐藥表型和基因型研究超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的流行情況，以指導(dǎo)臨床合理用藥。結(jié)果表明：以鹿源大腸桿菌的ESBLs耐藥質(zhì)粒為模板均擴(kuò)增出了與預(yù)期片段大小相符的TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型基因。84株大腸桿菌為產(chǎn)ESBLs株，占56%。PCR擴(kuò)增表明TEM、CTX-M、SHV、OXA陽性率分別為23.33%、3.33%、25.33%、8%。有9株同時檢測出TEM和SHV基因(占6%)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對藥物的耐藥性明顯比非產(chǎn)酶大腸桿菌嚴(yán)重。

國家自然科學(xué)基金(31502119)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q14002)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2572015CA21)

馮濤，女，20歲，本科生；主要從事動物藥理學(xué)研究。

*通訊作者：薛原，E-mail：xueyuan-1978@163.com