LA/C14DMAO/H2O體系多結(jié)構(gòu)自組裝體及其模板金納米材料制備與性能

馮 磊 郝京誠(chéng)

（山東大學(xué)，膠體與界面化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

LA/C14DMAO/H2O體系多結(jié)構(gòu)自組裝體及其模板金納米材料制備與性能

馮 磊 郝京誠(chéng)*

（山東大學(xué)，膠體與界面化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

月桂酸（LA）與十四烷基二甲基氧化胺（C14DMAO）形成的無鹽陰/陽離子表面活性劑混合體系表現(xiàn)出豐富的相行為。運(yùn)用冷凍蝕刻透射電子顯微鏡 （FF-TEM）和偏光顯微鏡（POM）、差示掃描量熱（DSC）、流變和2H NMR測(cè)定對(duì)體系相行為和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)水溶液中可自聚集形成膠束（L1）、層狀（Lαl）、囊泡（Lαν）和凝膠相。以膠束相和層狀相為軟模板制備了金納米材料，運(yùn)用透射電子顯微鏡（TEM）和能譜儀（EDS）表征了金納米材料。與用傳統(tǒng)陽離子表面活性劑溶液制備金納米材料相比，該體系由于具有自身還原性而不需要加入還原劑NaBH4。實(shí)驗(yàn)證明：還原過程不會(huì)破壞模板溶液原有微觀結(jié)構(gòu)，且可通過調(diào)控聚集體結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)控制制備金納米材料形貌的目的。HK-2細(xì)胞的噻唑藍(lán)（MTT）比色法實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，本體系制備的球形金納米材料作為基因載體具有高效和低毒的特點(diǎn)，在基因治療中具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可為尋求安全可靠的基因治療途徑提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論參考。

月桂酸；十四烷基二甲基氧化胺；相行為；模板；金納米材料

1 引 言

眾所周知，表面活性劑混合體系相較于單一表面活性劑體系更易自組裝形成各種形態(tài)的聚集體，且混合體系表現(xiàn)出多樣的相行為和溶液性質(zhì)。例如，混合體系通常比單一組分具有更低的表面張力和臨界膠束濃度；由于陰、陽離子表面活性劑可通過靜電作用形成離子對(duì)，它們?cè)谒芤褐锌尚纬啥嘟Y(jié)構(gòu)的聚集體。自1989年美國(guó)科學(xué)家Kaler等1觀察到陰/陽離子表面活性劑復(fù)配體系中自發(fā)形成囊泡以來，不同領(lǐng)域科學(xué)家對(duì)該類體系進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。陰/陽離子表面活性劑混合體系包括有鹽及無鹽兩類。早期研究主要集中在含鹽體系，這類體系中，由于溶液中表面活性劑反離子形成鹽對(duì)膜電荷有靜電屏蔽作用，在等摩爾或接近等摩爾混合時(shí)產(chǎn)生大量的沉淀，限制了其應(yīng)用2–5。而無鹽陰/陽離子表面活性劑溶液體系由于其低離子強(qiáng)度、低滲透壓以及聚集體雙分子層膜表面電荷未被靜電屏蔽等優(yōu)點(diǎn)，可以形成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的聚集體，逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)6–11。

金納米材料由于在催化、傳感、生物成像、藥物傳輸?shù)确矫嫠w現(xiàn)出的優(yōu)異電學(xué)、光學(xué)及熱學(xué)性質(zhì)，其形貌和尺寸的可控制備也受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視12–22。本文研究了月桂酸（LA）與十四烷基二甲基氧化銨（C14DMAO）所構(gòu)筑的無鹽陰/陽離子表面活性劑混合體系的相行為及兩者在水溶液中的聚集特性。烷基二甲基氧化胺是一種非離子型表面活性劑，可以通過調(diào)控溶液pH值改變其質(zhì)子化程度。在酸性條件下，C14DMAO由于質(zhì)子化，結(jié)合H+而使膠束帶正電荷，溶液表現(xiàn)出陽離子表面活性劑的性質(zhì)；而在中性和堿性條件下則表現(xiàn)出非離子表面活性劑性質(zhì)。在本體系中，我們選擇膠束（L1相）和層狀（Lαl相）溶液作為軟模板，利用質(zhì)子化后C14DMAOH+的羥基所具有的還原性，實(shí)現(xiàn)了在溶液中通過C14DMAOH+離子還原氯金酸（HAuCl4）制備了金納米材料。與傳統(tǒng)陽離子表面活性劑溶液制備金納米材料相比，本方法無需加入NaBH4、抗壞血酸、檸檬酸鈉等還原劑，樣品溶液既作為模板溶液，又兼具還原性。實(shí)驗(yàn)證明，還原過程不會(huì)破壞模板溶液原有微觀結(jié)構(gòu)，并可通過調(diào)控模板溶液的自組裝結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)金納米材料形貌的可控制備23，提供了納米材料制備的新途徑。納米材料作為基因載體應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域的研究，目前主要集中在陽離子高分子納米材料，如聚乙烯亞胺、多聚堿性氨基酸等24–26。本實(shí)驗(yàn)中我們將合成的金納米材料作為基因載體，對(duì)其潛力進(jìn)行了初步研究。相較于傳統(tǒng)表面活性劑制備的金納米材料，本文合成的金納米材料可以在更低濃度下壓縮DNA分子，并且通過人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞的噻唑藍(lán)（MTT）比色法實(shí)驗(yàn)證明，其具有更好的生物兼容性。本文的研究結(jié)果為尋求安全可靠的基因治療途徑提供理論參考，并對(duì)藥物緩釋、基因傳遞、無機(jī)納米材料的軟模板制備等具有指導(dǎo)意義。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

十四烷基二甲基氧化胺由Clariant公司提供的25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，w）的溶液，干燥后經(jīng)丙酮兩次重結(jié)晶得到；月桂酸（LA），化學(xué)純，梯希愛上?；稍噭┯邢薰?；氯金酸（HAuCl4），化學(xué)純，西亞試劑；雙鏈DNA鈉鹽（dsDNA），500–600 堿基對(duì)，ACROS（美國(guó)）；噻唑藍(lán)，純度≥ 98%， Amresco（美國(guó)）；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素和鏈霉素，北京索萊寶科技有限公司；人腎小管上皮細(xì)胞 HK-2，上海滬震生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用超純水由成都優(yōu)普UPHWIII-90T型超純水儀制備，其電阻率為18.25 MΩ·cm。

2.2 樣品制備

樣品配制及相行為研究：在C14DMAO的濃度（cC14DMAO） < 100 mmol·L–1時(shí)，將120個(gè)LA與C14DMAO的混合樣品溶液在（25.0 ± 0.1） °C下平衡四周以上，期間不斷振蕩樣品加快其相平衡，直至觀察溶液的外觀不再發(fā)生變化。相邊界的確定通過目視和偏光觀察，并輔以電導(dǎo)率測(cè)定。

金納米顆粒的制備：配制 20 mmol·L–1的氯金酸（HAuCl4）溶液，避光低溫保存。將HAuCl4溶液緩慢滴加到低速攪拌的模板溶液中，滴加完成后，避光繼續(xù)低速攪拌12 h。隨后，以8000 r·min–1離心模板溶液30 min，保留離心管底部沉淀，傾掉模板溶液，加入超純水，渦旋振蕩，離心分離，重復(fù)三次。將清洗干凈的金納米材料放入干燥器中室溫干燥，密封保存。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器和方法

電導(dǎo)率及pH值的測(cè)定：使用上海雷磁儀器廠生產(chǎn)的型號(hào)為DDSJ-308F的電導(dǎo)率儀和型號(hào)為DJS-10C的電極在（25.0 ± 0.5） °C下測(cè)定溶液電導(dǎo)率。使用德國(guó)賽多利斯公司生產(chǎn)的PB-21 pH計(jì)在（25.0 ± 0.5） °C下測(cè)定pH值。

流變測(cè)定：流變數(shù)據(jù)的測(cè)定在美國(guó)HAAKE 公司RS6000流變儀上通過錐-平板轉(zhuǎn)子系統(tǒng)（C35/1）測(cè)量，頻率掃描的范圍為0.01–10 Hz。所有樣品在測(cè)試之前均恒溫平衡穩(wěn)定至少四周。

冷凍蝕刻透射電鏡觀察（FF-TEM）：樣品的刻蝕和復(fù)形通過德國(guó)Leica公司EM BAF 060冷凍蝕刻制樣臺(tái)完成，通過日本JEM-1400電子顯微鏡（JEOL）觀察，電壓120 kV，圖像使用美國(guó)Gatan 公司831 CCD儀（2.7 K × 2.7 K）采集記錄。

偏光觀察是在德國(guó)ZEISS公司AXIOSKOP 40/40 FL顯微鏡上進(jìn)行，將幾滴溶液滴在載玻片上，用蓋玻片蓋住以免溶液揮發(fā)。

氘核磁共振（2H NMR）波譜表征：樣品用重水（D2O）配制（1.0 mL），平衡兩周后轉(zhuǎn)移至核磁管（直徑為5 mm），繼續(xù)平衡兩周。使用配置脈沖場(chǎng)梯度模塊（z-軸）的德國(guó)Bruker公司Avance 400核磁儀進(jìn)行2H NMR測(cè)定。

金納米材料的表征：將放置金納米材料的離心管中加入適量的乙醇，超聲30 min，然后將乙醇分散滴加在銅網(wǎng)上，在紅外燈下烘干銅網(wǎng)，在日本JEM-1400電子顯微鏡下觀察，電壓120 kV，圖像通過美國(guó)Gatan公司831 CCD儀（2.7 K × 2.7 K）采集記錄，元素分析結(jié)果通過英國(guó)OXFORD公司INCA-X能譜儀采集。

金納米材料與DNA分子相互作用：用紫外-可見（UV-Vis）光譜表征，使用帶有變溫裝置的日本日立公司U-4100紫外分光光度計(jì)，純水作為空白，測(cè)試光路長(zhǎng)度為1 cm，波長(zhǎng)掃描范圍為400–700 nm和220–320 nm。樣品溶液用一系列特定濃度金納米材料儲(chǔ)備液與DNA儲(chǔ)備液混合配制而成。樣品溶液在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h，靜置12 h后觀察變化。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）：人腎小管上皮細(xì)胞HK-2使用加有10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 units·mL–1）、鏈霉素（100 μg·mL–1）的RPMI-1640培養(yǎng)液在5%CO2培養(yǎng)箱中37 °C下培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的細(xì)胞消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 104個(gè)/mL，以每孔體積200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，各物質(zhì)每一染毒濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞染毒培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板, 每孔加入20 μL MTT溶液, 放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。然后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），取上層清液使用美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的型號(hào)為Multiskan FC酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（OD），取三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出。

3 結(jié)果與討論

3.1 LA/C14DMAO/H2O體系相行為

由于LA在水中溶解度很小，所以LA/C14DMAO/ H2O體系是C14DMAO膠束水溶液中增溶LA分子，然后二者相互作用形成各種聚集結(jié)構(gòu)。首先將不同量的LA加入到一系列固定濃度的C14DMAO水溶液中，振蕩混合均勻之后置于（25.0 ± 0.1） °C條件下平衡四周以上。觀察樣品溶液并輔以電導(dǎo)率等手段確定體系相邊界，繪出相圖，如圖1a所示。混合體系表現(xiàn)出豐富的相行為：均勻的膠束（L1相）；上部為淺藍(lán)色的Lα相而下部為透明L1相兩相；粘度較低可以流動(dòng)的Lα相，粘度很高的凝膠（gel）相，以及上部為白色沉淀而下部為淺藍(lán)色Lα相的兩相。由相圖（圖1a）可以看到：當(dāng)固定C14DMAO濃度時(shí)，隨LA濃度的增大，復(fù)配體系由膠束相（L1）向膠束/層狀混合相（L1/Lα）轉(zhuǎn)變，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閱我粚訝頛α相以及凝膠相；繼續(xù)增加LA濃度，則可被層狀結(jié)構(gòu)雙分子層的疏水部分增溶，LA不能被C14DMAO膠束全部增溶，則出現(xiàn)沉淀相。綜上所述，在LA/ C14DMAO/H2O體系中自組裝體的形成主要有兩種作用力：C14DMAO膠束增溶LA分子后，LA分子電離釋放出H+離子，將C14DMAO分子質(zhì)子化，兩者之間存在較強(qiáng)的靜電相互作用，如圖2c所示。質(zhì)子化后的C14DMAO分子之間不僅可以形成氫鍵，還可以與未質(zhì)子化的C14DMAO分子形成氫鍵，如圖2（a, b）所示27。本體系中多種結(jié)構(gòu)自組裝體的構(gòu)筑主要是由于氫鍵和靜電作用共同驅(qū)動(dòng)的結(jié)果。

圖1 （a） LA/C14DMAO/H2O體系的相圖；（b） 固定C14DMAO濃度時(shí)LA/C14DMAO/H2O體系的電導(dǎo)率（κ） （▲）和pH值（△）隨LA濃度（cLA）變化的數(shù)據(jù)Fig.1 （a） Phase diagram of LA/C14DMAO/H2O system； （b） conductivity （κ） （▲） and pH （△） data of LA/C14DMAO/H2O system at a fixed concentration of C14DMAOwith varying LA concentration （cLA）

為了進(jìn)一步確定相邊界，我們選擇了一個(gè)系列的典型樣品進(jìn)行研究。向60 mmol·L–1C14DMAO的膠束溶液中加入不同量的LA，觀察隨著體系不斷增溶LA而出現(xiàn)的相變化。當(dāng)LA加入量較少時(shí)，首先出現(xiàn)的是粘度極低、透明的單相溶液，即膠束相（L1相）。當(dāng)LA的濃度介于20–28 mmol·L–1之間時(shí)，體系分為兩相，上相是雙折射的Lα相，下相是L1相。當(dāng)LA的濃度介于28–42 mmol·L–1之間時(shí)，體系呈現(xiàn)雙折射的Lα單相區(qū)。當(dāng)LA濃度增加到42–55 mmol·L–1時(shí)，體系聚集體表現(xiàn)為粘度很高的凝膠相。與相轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)，體系的電導(dǎo)率和pH值也發(fā)生相應(yīng)變化，如圖1b所示。從圖中可以看出，由于LA作為一種弱酸可以電離出部分的H+，樣品的pH值隨著LA的加入量的增大而降低。對(duì)于電導(dǎo)率數(shù)據(jù)，由于LA/C14DMAO/H2O體系是無鹽體系，因此體系的電導(dǎo)率比較低。在L1相內(nèi)隨著LA濃度的增加，整個(gè)系列的樣品溶液的電導(dǎo)率也隨之增加，這是由于C14DMAO分子能夠被LA電離出的H+質(zhì)子化而形成陽離子C14DMAOH+，導(dǎo)致樣品溶液電導(dǎo)率上升。在Lα相內(nèi)，樣品溶液的電導(dǎo)率值急劇降低，這是由于在該范圍內(nèi)有囊泡結(jié)構(gòu)形成，離子被囊泡所包覆，導(dǎo)致囊泡相即使在比較高的離子濃度時(shí)也具有比較低的電導(dǎo)率值28。

圖2 LA/C14DMAO/H2O體系中的氫鍵及靜電相互作用示意圖Fig.2 Schematic representation of hydrogen bonding and electrostatic force in LA/C14DMAO/H2O system

表面活性劑溶液層狀、六角狀聚集結(jié)構(gòu)在偏光顯微鏡下可以明顯觀察到紋理效應(yīng)，但無偏光時(shí)很少觀察到彩色紋理的存在。本體系由于混合溶液中的表面活性劑自組裝形成的層狀相具有固定層間距，無需偏振光存在下對(duì)可見光有布拉格反射產(chǎn)生明顯彩色紋理29。如圖3所示，該體系樣品從不同角度觀測(cè)，溶液顯現(xiàn)不同靚麗的彩色紋理，是溶液樣品對(duì)可見光的反射作用。當(dāng)溫度在20–30 °C范圍內(nèi)，LA/C14DMAO/H2O體系在一定的濃度范圍內(nèi)無需偏振光，可以清晰觀察到彩色紋理樣品溶液，可借助肉眼觀測(cè)判斷層狀相的形成。

3.2 典型樣品聚集體形貌表征

FF-TEM是表征表面活性劑溶液自聚集結(jié)構(gòu)的重要手段24，我們選擇了兩個(gè)Lα相樣品進(jìn)行觀察，結(jié)果示于圖4。圖4a是60 mmol·L–1C14DMAO/30 mmol·L–1LA樣品的FF-TEM結(jié)果，可以看到：較稀的層狀相溶液樣品由未閉合的雙分子層組成，層狀相的層間距為（25 ± 2） nm，該樣品在偏光顯微鏡下是彩色鑲嵌狀雙折射紋理，如圖4b所示。當(dāng)LA濃度升高至45 mmol·L–1時(shí)，如圖4c所示，雙分子層膜閉合，單層囊泡出現(xiàn)，它們的尺寸分布在20–80 nm范圍。原因可能是隨著雙分子層中插入越來越多的LA分子，膜的曲率變大，造成雙分子層膜閉合。

3.3 流變學(xué)性質(zhì)

流變學(xué)性質(zhì)是通過對(duì)樣品宏觀性質(zhì)的表征，反映樣品微觀結(jié)構(gòu)的變化。選擇固定C14DMAO濃度為60 mmol·L–1，LA濃度分別為30、35、40和45 mmol·L–1的樣品進(jìn)行了流變性質(zhì)表征。對(duì)Lα相區(qū)的樣品流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了振蕩掃描模式的粘彈性研究，如圖5所示。對(duì)于四個(gè)Lα相樣品，在0.1–100 Hz的頻率掃描范圍內(nèi)，彈性模量（G'）和粘性模量（G"）隨頻率的增加緩慢上升，且在頻率掃描范圍內(nèi)G'高于G"，復(fù)合粘度（η*）隨頻率呈線性下降趨勢(shì)，這是典型的層狀Lα相的流變學(xué)性質(zhì)。并且隨著LA濃度的依次增大，樣品的彈性模量、粘性模量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，即濃度升高樣品的粘彈性均增大。

圖4 LA/C14DMAO/H2O體系聚集體顯微鏡圖Fig.4 Micrograph images of aggregates in LA/C14DMAO/H2O system

隨著C14DMAO質(zhì)子化程度增加，混合體系的相轉(zhuǎn)變過程也可通過流變性質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。圖6b給出了總濃度為100 mmol·L–1，不同比例LA的混合樣品溶液的剪切粘度隨剪切速率變化的曲線，溶液均表現(xiàn)出剪切變稀的性質(zhì)。且隨體系LA配比的增大，樣品剪切粘度呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著體系中LA濃度的增大，更多的C14DMAO分子被質(zhì)子化，從而導(dǎo)致C14DMAO分子與LA分子間氫鍵和靜電作用力都進(jìn)一步增強(qiáng)，體系粘度升高，分子空間堆積構(gòu)型改變，誘導(dǎo)平面層狀結(jié)構(gòu)向囊泡轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變過程有FF-TEM結(jié)果得到證明。

圖5 LA/C14DMAO/H2O 體系Lα相樣品的振蕩剪切流變曲線Fig.5 Oscillatory shear rheological curves of Lαphase samples in LA/C14DMAO/H2O system

圖6 LA/C14DMAO/H2O 體系Lα相樣品的穩(wěn)態(tài)剪切流變曲線Fig.6 Steady shear rheological curves of Laphase samples in LA/C14DMAO/H2O system

3.4 差示掃描量熱確定相轉(zhuǎn)變溫度

差示掃描量（DSC）可以研究凝膠相和Lα相中亞穩(wěn)定相的轉(zhuǎn)變溫度及特征。如圖7所示，樣品加熱時(shí)可以觀察到相轉(zhuǎn)變溫度的存在，宏觀上樣品從類固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，這是類似于熔化的一個(gè)過程；微觀上樣品的雙分子層膜發(fā)生了從結(jié)晶態(tài)到液態(tài)的轉(zhuǎn)變。隨著LA濃度的升高，凝膠化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）由35 °C上升至41 °C，這是兩個(gè)因素共同作用的結(jié)果：一是隨著LA濃度的升高，更多的C14DMAO分子發(fā)生質(zhì)子化，質(zhì)子化后陽離子C14DMAOH+與LA分子間的氫鍵和靜電作用力都進(jìn)一步增強(qiáng)；二是LA具有較高的鏈熔化溫度（44 °C），隨著LA濃度的升高，質(zhì)子化后陽離子C14DMAOH+與LA分子間氫鍵和靜電作用力都進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致兩者共結(jié)晶作用也隨之增強(qiáng)。因此，LA濃度較高的樣品其相轉(zhuǎn)變溫度接近LA的鏈熔化溫度。

圖7 （a） C14DMAO濃度固定為60 mmol·L-1，LA濃度分別為45、47.5、50、52.5和55 mmol·L-1時(shí)凝膠樣品在LA/C14DMAO/H2O體系中的差示掃描量熱（DSC）曲線，（b） C14DMAO濃度固定為60 mmol·L-1時(shí)凝膠化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）隨LA濃度的變化曲線Fig.7 （a） Differential scanning calorimetry （DSC） curves of hydrogel samples in LA/C14DMAO/H2O system with 60 mmol·L-1C14DMAO with different LA concentrations of 45， 47.5， 50， 52.5， and 55 mmol·L-1， （b） gel transition temperature （Tg） as a function of LA concentration with 60 mmol·L-1C14DMAO

3.5 氘核磁共振(2H NMR)研究

圖8 不同LA濃度時(shí)LA/C14DMAO/H2O體系2H NMR譜圖Fig.82H NMR spectra of LA/C14DMAO/H2O system with different LA concentrations

cC14DMAO = 60 mmol·L–1. Phase transition is from L1phase （a, b） to Lα1phase （c, d）, and finally to Lαvphase （e–g） with the increase of LA concentration.

核磁共振技術(shù)通過研究表面活性劑分子在磁場(chǎng)中由非平衡態(tài)到平衡態(tài)的過程，即弛豫現(xiàn)象，推斷表面活性劑分子聚集體在溶液中的結(jié)構(gòu)信息30–32。最適合弛豫研究的核為2H（I = 1），其弛豫中起關(guān)鍵作用的因素是四極作用。通過2H NMR測(cè)試的四極裂分法，研究氘代水溶液中層狀結(jié)構(gòu)的各向異性程度，由此可以判斷溶液中的表面活性劑分子微觀聚集體結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)演變33–35。對(duì)于各向同性的體系，2H NMR 譜圖呈現(xiàn)為一個(gè)單峰，而對(duì)于各向異性的體系，則可以觀測(cè)到一組對(duì)稱的裂分峰。通過在室溫條件下對(duì)樣品2H NMR的表征（圖8），我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)C14DMAO濃度為60 mmol·L–1時(shí)，增大LA的濃度，體系由膠束相（L1，氘譜核磁為尖銳的單峰）向平面層狀相（Lα，氘譜核磁為分裂的雙峰）轉(zhuǎn)變，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槟遗菹啵↙αv，氘譜核磁為圓潤(rùn)的、寬的單峰），這與FF-TEM的結(jié)果（圖3）證明的相結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變過程一致。

圖9 （a） 60 mmol·L-1C14DMAO/10 mmol·L-1LA膠束相和（b） 60 mmol·L-1C14DMAO/30 mmol·L-1LA層狀相為模板還原HAuCl4所制備金納米材料的TEM照片；60 mmol·L-1C14DMAO/30 mmol·L-1LA模板溶液加入HAuCl4前（左）和金納材料生成后（右） （c）未施加及（d）施加偏光的照片；（e） 60 mmol·L-1C14DMAO/30 mmol·L-1LA及（f） 60 mmol·L-1C14DMAO/ 10 mmol·L-1LA 模板溶液還原HAuCl4形成的金納米材料的EDS圖譜Fig.9 TEM images of AuNPs prepared in （a） L1phase solution of 60 mmol·L-1C14DMAO/10 mmol·L-1LA and （b） Lαlphase solution of 60 mmol·L-1C14DMAO/30 mmol·L-1LA； photographs of typical samples without （c） and with （d） crossed polarizers before （left） and after （right） the addition of HAuCl4； EDS spectra of Au NPs prepared in 60 mmol·L-1C14DMAO/30 mmol·L-1LA （e） and 60 mmol·L-1C14DMAO/10 mmol·L-1LA solution （f）

3.6 模板法制備金納米材料

成交量(VOL)：是指某一段時(shí)間內(nèi)具體的交易數(shù)。成交量是判斷市場(chǎng)走勢(shì)的重要指標(biāo)，反映了市場(chǎng)的活躍程度和資金規(guī)模情況。根據(jù)供需理論，成交量是股票價(jià)格的主宰。當(dāng)投資者情緒高昂，進(jìn)入證券市場(chǎng)意愿強(qiáng)烈，供大于求，推動(dòng)股價(jià)上漲，反之，股價(jià)下跌。

在無機(jī)納米材料的制備中，表面活性劑自組裝體常被作為模板來控制納米材料的結(jié)構(gòu)、尺寸和形狀36–38。本實(shí)驗(yàn)中，探討了LA/C14DMAO/H2O體系自組裝體作為軟模板制備金納米材料。被LA質(zhì)子化后的陽離子C14DMAOH+中的羥基具有還原性，可將HAuCl4還原形成金納米材料。依據(jù)相圖（圖1a）選擇L1相樣品：60 mmol·L–1C14DMAO/10 mmol·L–1LA；Lα相樣品：60 mmol·L–1C14DMAO/30 mmol·L–1LA，用兩者分別作為模板還原HAuCl4，形成的金納米材料的TEM結(jié)果如圖9所示。由圖可以看出以L1相溶液還原HAuCl4時(shí)，形成近似球形金納米顆粒（圖9a），粒徑大小約（25 ± 5） nm。表面活性劑對(duì)納米材料形貌控制的原因十分復(fù)雜，在膠束溶液中制備納米材料時(shí)，其形成機(jī)理通常歸結(jié)為與表面活性劑濃度有關(guān)，也與表面活性劑分子在納米顆粒表面的吸附有關(guān)23，其過程示于圖10a。具體來說，表面活性劑分子在納米顆粒表面的吸附量主要取決于表面活性劑分子親水端基的極性，表面活性劑疏水尾鏈的長(zhǎng)度則影響晶種的增長(zhǎng)方向和不同方向的增長(zhǎng)速度。隨著表面活性劑濃度的增加，納米材料的形貌和尺寸更加均一。

利用層狀結(jié)構(gòu)對(duì)納米材料生長(zhǎng)的維度限制，采用Lαl層狀相溶液為模板還原HAuCl4得到了100–200 nm更大尺寸的類片狀金納米材料（圖9b）。我們推測(cè)其機(jī)理為：質(zhì)子化的陽離子C14DMAOH+具有較弱還原性，使得金晶種在層狀相雙分子層內(nèi)腔中緩慢生長(zhǎng)。受雙分子層空間限制以及C14DMAOH+與離子間的靜電吸引作用，兩者共同作用下導(dǎo)致類片狀金納米材料形成36，如圖10b所示。對(duì)比加入HAuCl4前后的模板溶液，可以發(fā)現(xiàn)：淡藍(lán)色的具有雙折射偏光紋理的層狀模板溶液在加入HAuCl4后變?yōu)樽丶t色（圖9c），偏光片下觀察卻依然具有雙折射偏光紋理（圖9d）。這說明在模板溶液還原HAuCl4形成金納米材料的過程中沒有破壞其層狀相微觀結(jié)構(gòu)，也證明了我們對(duì)機(jī)理的推測(cè)。最后，能譜結(jié)果證明在兩種模板溶液中均成功制備了金納米材料（圖9（e, f）。

圖10 LA/C14DMAO/H2O體系中質(zhì)子化陽離子C14DMAOH+還原HAuCl4形成金納米材料示意圖Fig.10 Schematic diagrams of the formation of Au NPs prepared from HAuCl4reduced by the protonation cation C14DMAOH+in LA/C14DMAO/H2O system

圖11 （a） Au NPs與Au NPs/DNA溶液的紫外-可見吸收光譜；（b） 固定DNA為0.5 mmol?L-1，改變Au NPs的濃度時(shí)Au NPs/DNA溶液的紫外-可見吸收光譜；（c） 固定DNA為0.5 mmol?L-1，改變Au NPs的濃度時(shí)不同C14DMAOH+濃度下Au NPs/DNA和C14DMAOH+/DNA溶液相行為 （○） 單相溶液，（●） 溶液發(fā)生相分離）；（d） 不同濃度下TTAB、C14DMAOH+和Au NPs對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響對(duì)比Fig.11 （a） UV-Vis absorption spectra of Au NPs and Au NPs/DNA solutions； （b） UV-Vis absorption spectra of Au NPs/DNA solutions at a fixed DNA concentration of 0.5 mmol?L-1with varying Au NPs concentration； （c） phase diagrams of Au NPs/DNA and C14DMAOH+/DNA solutions at a fixed DNA concentration of 0.5 mmol?L-1with varying Au NPs and C14DMAOH+concentration （○） single-phase solution and （●） phase-separated solutions）； （d） comparison of the percent inhibition curves of TTAB， C14DMAOH+， and Au NPs on HK-2 cell proliferation

3.7 金納米材料與DNA分子作用的探究

為了研究所制備金納米材料作為基因載體的能力，我們選擇在L1相模板溶液中制備的類球形金納米材料，利用紫外-可見光譜對(duì)納米金球與DNA分子的結(jié)合以及金納米球?qū)NA分子壓縮。如圖11a所示，加入DNA分子后，紫外-可見光譜最大吸收峰位置由之前的534 nm移動(dòng)到542 nm，發(fā)生了明顯的紅移，這說明金納米球結(jié)合到DNA分子骨架上，形成Au NPs/DNA復(fù)合物。由于此時(shí)Au NPs濃度較低，結(jié)合到DNA分子骨架上的AuNPs較少，DNA分子未被壓縮。隨著AuNPs濃度升高，在260 nm DNA分子特征吸收峰處，樣品溶液的紫外吸收逐步降低，說明溶液中DNA分子的濃度在下降，DNA分子所帶負(fù)電荷被結(jié)合于DNA分子骨架上的AuNPs中和，DNA分子被壓縮，如圖11b所示。

為進(jìn)一步驗(yàn)證AuNPs壓縮DNA分子的效能，我們選擇了質(zhì)子化后的C14DMAOH+作為對(duì)比，在固定DNA濃度條件下，對(duì)兩者與DNA混合溶液的相行為進(jìn)行了觀測(cè)。如圖11c所示，當(dāng)Au NPs濃度超過70 μmol·L–1時(shí)，樣品從均勻的澄清溶液轉(zhuǎn)變?yōu)橛谐恋砩傻膬上嗳芤?。由此可見，DNA分子電荷被AuNPs中和，空間構(gòu)象被壓縮，生成電中性Au NPs/DNA復(fù)合物沉淀。相較于質(zhì)子化的C14DMAOH+，壓縮DNA分子所需的AuNPs的臨界濃度低近一個(gè)數(shù)量級(jí)，這證明AuNPs壓縮DNA分子的高效性。

基因載體的毒性也用于考察載體的效能，探究了L1相模板溶液中制備的金納米材料的細(xì)胞毒性，選擇陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）和被乙酸質(zhì)子化后的兩性表面活性劑C14DMAOH+作為參照。使用MTT法檢測(cè)了三者在體外環(huán)境的細(xì)胞毒性，所用細(xì)胞為人腎小管上皮細(xì)胞HK-2。從圖11d可以得出，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著三者物質(zhì)劑量的增加，TTAB組和C14DMAOH+組細(xì)胞活性顯著下降；三種物質(zhì)劑量相同條件下，AuNPs組細(xì)胞存活率最高，TTAB組細(xì)胞存活率最低。當(dāng)AuNPs濃度達(dá)到500 μmol·L–1時(shí)，細(xì)胞存活率仍可以達(dá)到90%以上，證明我們制備的金納米材料兼具壓縮DNA分子，且具有較低細(xì)胞毒性。

4 結(jié) 論

詳細(xì)研究了LA/C14DMAO/H2O體系的相行為及形成的各種聚集結(jié)構(gòu)。在固定C14DMAO濃度時(shí)，隨著LA的加入，有明顯的相轉(zhuǎn)變過程，體系表現(xiàn)出豐富的相行為：膠束、膠束/層狀共存相、層狀相、囊泡相、凝膠、凝膠/沉淀共存相等。通過2H NMR和電導(dǎo)率測(cè)定、FF-TEM和偏光顯微鏡觀察等方法對(duì)上述相行為進(jìn)行了表征。DSC結(jié)果表明：隨著表面活性劑濃度的升高，凝膠化轉(zhuǎn)變溫度升高。層狀相樣品表現(xiàn)出典型的粘彈性的流變性質(zhì)，且常溫下隨表面活性劑濃度的增大，其粘彈性增強(qiáng)。以膠束和層狀相樣品分別為模板，利用體系中C14DMAOH+羥基的還原性，還原HAuCl4，制備了兩種不同形貌、尺寸的金納米材料，證明了模板溶液對(duì)金納米材料的形成和生長(zhǎng)起到了調(diào)控作用。相比傳統(tǒng)化學(xué)還原法制備金納米材料，本方法不需要額外加入NaBH4等還原劑，減少了還原劑的加入對(duì)模板溶液微觀結(jié)構(gòu)的破壞，對(duì)可控制備金納米材料提供了新的途徑。利用在膠束模板制備的類球形金納米材料，研究了其在作為基因載體的應(yīng)用潛力。實(shí)驗(yàn)證明：相比傳統(tǒng)表面活性劑載體，類球形金納米顆粒在低至70 μmol·L–1的濃度時(shí)即可壓縮DNA分子，且當(dāng)其濃度≤ 500 μmol·L–1范圍內(nèi)對(duì)HK-2細(xì)胞是安全的，說明Au納米球具有壓縮DNA分子高效性，并具有較低細(xì)胞毒性，為基因傳遞、基因治療等方面的潛在應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

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Preparation and Property of Gold Nanoparticles from Muliple Self-Assembled Structures as Templates in LA/C14DMAO/H2O System

FENG Lei HAO Jing-Cheng*
（Key Laboratory of Colloid and Interface Chemistry, Shandong University, Jinan 250100, P. R. China）

Rich phase behaνior was obserνed in salt-free cationic/anionic （catanionic） surfactant mixtures of lauric acid （LA） with a nonionic surfactant, tetradecyldimethylamine oxide （C14DMAO）, in water. The phase behaνior and microstructures of the LA/C14DMAO/H2O system were inνestigated by freeze-fracture transmission electron microscope （FF-TEM）, polarized optical microscope （POM）, differential scanning calorimetry （DSC）, rheological measurements, and2H NMR. A νariety of self-assembled microstructures were determined, including micelles （L1phase）, lamellae （Lαlphase）, νesicles （Lανphase） and gels. Using the L1and Lαlphases as the templates, gold nanoparticles could be produced, as confirmed by transmission electron microscope （TEM） and energy dispersiνe spectrometer （EDS）. Compared with the traditional method of preparing Au nanomaterials in aqueous solutions, this method can aνoid the addition of NaBH4as a reducing agent. The sample solution plays roles as a template and a reductant and the reduction process does not destroy the original self-assembled microstructures in the solution. Hence, by controlling the aggregate structures of the template solution, one can achieνe the goal of regulating the morphology of Au nanomaterials, which proνides a new path for the preparation of noble metal nanostructured materials with different shapes and structures. The results of the methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay with HK-2 cellsshow that, as a gene carrier, spherical Au-nanoparticles prepared in a micellar phase possess the characteristics of higher loading efficiency and lower toxicity than those obtained in traditional surfactant systems, demonstrating potential applications in gene therapy.

Lauric acid; Tetradecyldimethylamine oxide; Phase behaνior; Template; Au nanomaterial

O648

10.3866/PKU.WHXB201511193

Received: October 12, 2015； Revised: November 19, 2015； Published on Web: November 19, 2015.

*Corresponding author. Email: jhao@sdu.edu.cn； Tel: +86-531-88366074.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China （2140102006, 21273134） and Shandong Provincial Natural Science Foundation, China （ZR2013BQ025）.

國(guó)家自然科學(xué)基金（2140102006, 21273134）及山東省自然科學(xué)基金（ZR2013BQ025）資助項(xiàng)目

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