UPLC-MS/MS法測定人血漿中伏立康唑的濃度及其臨床應(yīng)用Δ

鐘　皎，郝　琨，裴澤軍（1.無錫市第二人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院藥劑科，江蘇無錫1400；.中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)重點實驗室，南京　10009）

·臨床藥學(xué)與研究·

UPLC-MS/MS法測定人血漿中伏立康唑的濃度及其臨床應(yīng)用Δ

鐘皎1＊，郝琨2，裴澤軍1#（1.無錫市第二人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院藥劑科，江蘇無錫214002；2.中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)重點實驗室，南京210009）

目的：建立測定人血漿中伏立康唑濃度的方法，并應(yīng)用于臨床。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。以酮康唑為內(nèi)標(biāo)，色譜柱為Shim-pack VP-ODS，流動相為水（含1‰甲酸及2 mmol/L乙酸銨）-乙腈，梯度洗脫，流速為0.3 ml/min，柱溫為40℃；采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 351.2→282.2（伏立康唑）、m/z 532.1→490.2（內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：伏立康唑血藥濃度在1～10 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 5，n＝5），定量下限為1 ng/ml；日內(nèi)、日間RSD＜10%；方法回收率＞90%（RSD＜8%），提取回收率＞70%（RSD＜8%）。采用該法檢測10例深部真菌感染患者體內(nèi)伏立康唑的血藥濃度為507.33～7 011.24 ng/ml，有3例患者的血藥濃度不在推薦治療濃度范圍內(nèi)。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于伏立康唑治療藥物監(jiān)測。

伏立康唑；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；血藥濃度；治療藥物監(jiān)測；侵襲性真菌感染

伏立康唑為新型三唑類抗真菌藥物，是治療侵襲性真菌感染的常見藥物之一[1-2]。但由于其潛在的藥物相互作用和代謝酶細(xì)胞色素P450（CYP）2C19的基因多態(tài)性，導(dǎo)致其個體間的藥動學(xué)差異較大[3-4]，有可能引發(fā)嚴(yán)重的藥品不良反應(yīng)（ADR），甚至有的ADR是不可逆的[5-7]。有研究表明，伏立康唑的血藥濃度與臨床療效、ADR的關(guān)系密切[8]。因此，建議對使用伏立康唑的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測。目前，測定伏立康唑的方法多為高效液相色譜（HPLC）法和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法[9-11]。為進(jìn)一步提高檢測效率，增強(qiáng)實用性、靈敏度和專屬性，本試驗建立了測定人血漿中伏立康唑濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，以便更準(zhǔn)確、快捷地向臨床提供血藥濃度監(jiān)測結(jié)果，為臨床安全、合理用藥提供參考。

1　材料

1.1儀器

AB Sciex 5500型超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB Sciex公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；AB-256-S型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Sorvall Stratos型臺式高速冷凍離心機(jī)（美國熱電公司）。

1.2藥品與試劑

注射用伏立康唑（美國Pfizer Limited公司，注冊證號：H2014073，批號：Z327401，規(guī)格：200 mg）；伏立康唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00862-200701，純度：100%）、酮康唑?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，批號：100294-200602，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜醇，水為超純水，其余試劑均為分析純?？瞻籽獫{由我院檢驗科提供。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：水（A相，含1‰甲酸及2 mmol/L乙酸銨）-乙腈（B相），梯度洗脫（0～2.5 min，10%→75%B；＞2.5～4.0 min，75%→98%B；＞4.0～5.5 min，98%B；＞5.5～6.0 min，98%→10%B；維持平衡2 min后，進(jìn)下一針）；流速：0.3 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μl。

采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測；噴霧電壓：4 500 V；溫度：350℃；輔助氣1（N2）壓力：13Arb；輔助氣2（N2）壓力：19Arb；氣簾氣（N2）壓力：20Arb；用于定量分析的離子對分別為m/z 351.2→282.2[伏立康唑，去簇電壓（DP）：150 eV，碰撞能量（CE）：23 eV）]，m/z 532.1→490.2（內(nèi)標(biāo)，DP：100eV，CE：43eV）。

2.2溶液的制備

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?0 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/ml的伏立康唑貯備液，置4℃冰箱中保存，備用。取伏立康唑貯備液適量，用甲醇稀釋制成所需質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品1 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為10μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱中保存，備用。

2.3血漿樣品處理

取空白血漿100μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為10μg/ml）10μl，渦旋10 s；加入乙醚1 ml，渦旋5 min，以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心5 min，取上清液800μl，于37℃水浴中揮干。殘渣用甲醇100μl復(fù)溶，再以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為18000r/min離心5min，取上清液5μl進(jìn)樣分析。

2.4方法學(xué)考察[12]

2.4.1專屬性考察在“2.1”項條件下，取空白血漿、空白血漿+伏立康唑+內(nèi)標(biāo)、患者用藥后的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，考察方法的專屬性。結(jié)果顯示，伏立康唑和內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形良好，其保留時間分別為5.08、4.38 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定，表明該方法專屬性良好。其典型色譜圖見圖1。

圖1　典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+伏立康唑+內(nèi)標(biāo)；C.患者用藥后的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.伏立康唑；2.內(nèi)標(biāo)Fig 1　Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+voriconazole+internal standard；C. plasma samples of patient after administration+internal standard；1. voriconazole；2.internal standard

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與定量下限的考察取空白血漿、相應(yīng)質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，分別配制成質(zhì)量濃度為1、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng/ml的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)、待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)w＝1/x2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.964 1x+0.022 6（r＝0.999 5，n＝5）。結(jié)果表明，伏立康唑的血藥濃度在1～10 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為1ng/ml[信噪比（S/N）＝10）]。

2.4.3精密度與回收率試驗取空白血漿、相應(yīng)質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，分別配制定量下限濃度（1 ng/ml）血漿樣品和低、中、高質(zhì)量濃度（3、500、7 500 ng/ml，下同）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣分析。每質(zhì)量濃度取5樣本分析，連續(xù)測定5 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品的測得質(zhì)量濃度，考察方法的日內(nèi)、日間精密度。以測得質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度的比值來考察樣品的方法回收率，以經(jīng)提取所得血漿樣品的色譜峰面積與未經(jīng)提取所得的色譜峰面積的比值來考察樣品的提取回收率。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD均＜10%，各樣品的方法回收率＞90%（RSD＜8%），提取回收率＞70%（RSD＜8%）。精密度與回收率試驗結(jié)果見表1。

表1　精密度與回收率試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1　Results of accuracy and recovery tests（±s，n＝5）

表1　精密度與回收率試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1　Results of accuracy and recovery tests（±s，n＝5）

加入質(zhì)量濃度，ng/ml 0 001 0 003 0 500 7 500日間精密度測得質(zhì)量濃度，ng/ml 0.91±0.085 3.23±0.21 522.17±48.42 7 718.59±590.14 RSD，% 8.71 6.04 9.16 6.54日內(nèi)精密度測得質(zhì)量濃度，ng/ml 0.95±0.079 3.35±0.37 517.67±31.02 7 302.41±472.97 RSD，% 8.12 7.43 6.94 5.11方法回收率，%計算值95.24±7.01 92.78±8.23 107.75±6.57 102.57±3.14 RSD 7.41 7.79 6.39 2.91提取回收率，%計算值71.18±5.97 75.21±6.06 73.90±4.10 76.22±3.04 RSD 6.09 7.58 5.24 3.82

2.4.4基質(zhì)效應(yīng)取空白血漿90 μl，按“2.3”項下方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各適量，配制成定量下限濃度血漿樣品和低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，每質(zhì)量濃度取6樣本分析，得相應(yīng)峰面積（A）；取相應(yīng)質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的混合溶液直接進(jìn)樣，得相應(yīng)峰面積（B），基質(zhì)效應(yīng)＝A/B×100%。結(jié)果顯示，定量下限濃度血漿樣品和低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為（97.23±2.55）%、（101.69±3.01）%、（99.84± 1.69）%和（103.77±2.17）%，RSD＜2.82%，表明該方法不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4.5穩(wěn)定性取空白血漿、相應(yīng)質(zhì)量濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，配制定量下限濃度的血漿樣品和低、中、高質(zhì)量的濃度質(zhì)控樣品，分別考察其在室溫放置24 h、經(jīng)歷反復(fù)凍融3次、－70℃冷凍保存30 d等條件下的穩(wěn)定性，每質(zhì)量濃度取5樣本進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，各樣品在上述條件下均穩(wěn)定，RSD＜10%。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2。

2.5臨床應(yīng)用

選擇擬采用伏立康唑治療的深部真菌感染患者10例，按如下給藥方法進(jìn)行治療：首日予注射用伏立康唑400 mg，ivgtt，bid；于第2天起予注射用伏立康唑200 mg，ivgtt，bid。連續(xù)給藥3 d后，于下次給藥前1 h抽取各患者外周靜脈血4 ml，至肝素鈉抗凝管中，以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心5 min，取上清液，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定。得患者體內(nèi)伏立康唑的血藥濃度為507.33～7 011.24 ng/ml。10例患者的臨床資料和伏立康唑血藥濃度檢測結(jié)果見表3。

表2　穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2　Results of stability tests（±s，n＝5）

表2　穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2　Results of stability tests（±s，n＝5）

加入質(zhì)量濃度，ng/ml 0 001 0 003 0 500室溫放置24 h測得質(zhì)量濃度，ng/ml 0.93±0.04 3.26±0.19 531.84±30.74 RSD，% 4.12 5.41 5.09經(jīng)歷反復(fù)凍融3次測得質(zhì)量濃度，ng/ml 0.90±0.07 3.29±0.26 527.17±24.69 RSD，% 7.24 6.67 4.58－70℃冷凍保存30 d測得質(zhì)量濃度，ng/ml 0.91±0.09 3.31±0.27 530.47±26.32 RSD，% 9.01 7.22 4.92

表3　患者的臨床資料和伏立康唑血藥濃度檢測結(jié)果Tab 3　Patients’clinical data and results of plasma concentration determination of voriconazole

3　討論

在流動相洗脫方式篩選的過程中，為進(jìn)一步節(jié)省分析時間，本課題組采用了梯度洗脫的方式，同時在水相中添加了甲酸，以有利于正離子的質(zhì)子化，維持樣品在流動相中的電離狀態(tài)，使峰形得以改善。在內(nèi)標(biāo)化合物的選擇中，筆者篩選了氟康唑、尼群地平和酮康唑等化合物，綜合考慮保留時間、響應(yīng)值、雜質(zhì)干擾等因素，最終選擇酮康唑作為內(nèi)標(biāo)。筆者曾考慮采用直接沉淀蛋白法和固相萃取法處理血漿樣品，前者常用的沉淀試劑包括高氯酸、三氟乙酸和乙腈等，但提取回收率較低，可能與其可氧化破壞伏立康唑和內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，而后者操作煩瑣且會增加檢測的成本。故綜合比較，最終選擇了以乙醚作為萃取溶劑的液-液萃取法，此法操作簡便，且可獲得滿意的提取效果。

關(guān)于伏立康唑血藥濃度測定方法，文獻(xiàn)報道較多的是HPLC法[9-10]。但對于深部真菌感染的患者而言，其病情較為危重，且聯(lián)合用藥較多，采用常規(guī)的HPLC法常會受到聯(lián)合用藥的干擾，定量下限只能達(dá)到50 ng/ml左右，且分析時間較長，其準(zhǔn)確性、靈敏度和檢測效率不甚理想。Cheng Y等[11]采用分子排阻和柱切換分離技術(shù)的液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法，但其成本高且操作煩瑣，難以在臨床上推廣使用。為改進(jìn)上述檢測方法，本試驗建立了UPLC-MS/MS法，通過UPLC來提升分析速度，將樣本的分析時間由原來的＞10 min縮短至6 min，同時，串聯(lián)質(zhì)譜又較一級質(zhì)譜能更精準(zhǔn)地檢測待測物。因此，本試驗所建立的方法快速、簡單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能為臨床提供可靠的測定結(jié)果，可滿足臨床治療藥物監(jiān)測的需求。

據(jù)文獻(xiàn)[13-15]報道，伏立康唑的肝毒性、橫紋肌溶解等ADR與其血藥濃度呈正相關(guān)，個體差異和藥物相互作用等因素會導(dǎo)致血藥濃度偏高（產(chǎn)生毒性）或血藥濃度過低（低于有效治療濃度而導(dǎo)致治療失?。?，因此臨床有必要對伏立康唑的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測。參考伏立康唑的藥動學(xué)特征，首日靜脈給予伏立康唑負(fù)荷劑量400 mg，bid，1～2 d后血藥濃度即可達(dá)穩(wěn)態(tài)[16]，故將患者的采血時間定于用藥3 d后，以確?；颊唧w內(nèi)的伏立康唑血藥濃度已達(dá)穩(wěn)態(tài)。目前，推薦的伏立康唑有效治療濃度范圍為1.0～5.5μg/ml[8]，而本研究中10例患者血藥濃度的監(jiān)測結(jié)果顯示，有3例患者的血藥濃度不在此范圍內(nèi)（其中，2例偏高，1例偏低），醫(yī)師可根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果調(diào)整給藥劑量，確?；颊叩玫接行е委?，為臨床合理使用伏立康唑提供依據(jù)。

本試驗以乙醚為萃取溶劑對血漿樣品進(jìn)行處理，以酮康唑為內(nèi)標(biāo)，建立了測定人血漿中伏立康唑濃度的UPLC-MS/MS法，該方法具有快速、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點，可用于伏立康唑治療藥物監(jiān)測。

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（編輯：張元媛）

Concentration Determination of Voriconazole in Human Plasma by UPLC-MS/MS and Its ClinicalApplication

ZHONG Jiao1，HAO Kun2，PEI Zejun1（1.Dept.of Pharmacy，Wuxi Second People’s Hospital/Wuxi Second Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Jiangsu Wuxi 214002 China；2.Key Lab of Drug Metabolism and Pharmacokinetics，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To develop a method for concentration determination of voriconazole in human plasma and apply it in the clinic.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.Using ketoconazole as internal standard，the determination was performed on Shim-pack VP-ODS column with mobile phase consisted of water（containing 1‰formic acid and 2 mmol/L ammonium acetate）-acetonitrile（gradient elution）at flow rate of 0.3 ml/min and column temperature of 40℃.The electrospray ion source，positive ionizing pattern and multiple reaction monitoring were used；the mass transition ion-pairs of voriconazole and internal standard were m/z 351.2→282.2 and m/z 532.1→490.2.RESULTS：The linear range of voriconazole were 1-10 000 ng/ml（r＝0.999 5，n＝5），and the limit of quantitation was 1 ng/ml；RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%；method recovery was higher than 90%（RSD＜8%），and extraction recovery was higher than 70%（RSD＜8%）.The plasma concentrations of voriconazole in 10 patients with invasive fungal infection determined by this method were 507.33-7 011.24 ng/ml，and those of 3 patients were outside the recommended treatment concentration range.CONCLUSIONS：The established method is fast，accurate and sensitive，and can be applied for the therapeutic drug monitoring of voriconazole.

Voriconazole；UPLC-MS/MS；Plasma concentration；Therapeutic drug monitoring；Invasive fungal infection

R917

A

1001-0408（2016）29-4064-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.29.09

無錫市醫(yī)院管理中心醫(yī)學(xué)科研藥學(xué)項目（No.YGZXY1301）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0510-68563496。E-mail：zhong112@126.com

主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0510-68563360。E-mail：pei-zj@126.com

（2015-11-03

2016-02-02）