姜一鳴 姜學(xué)連劉新軍 孫 建 王慧凱 路玉良 宋榮強(qiáng) 魏 銘
(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 濱州 256600)
·研究報(bào)告·
劉豨逍遙五苓湯對(duì)肝纖維化大鼠病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響*
姜一鳴 姜學(xué)連△劉新軍 孫 建 王慧凱 路玉良 宋榮強(qiáng) 魏 銘
(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 濱州 256600)
目的 觀察劉豨逍遙五苓湯對(duì)肝纖維化大鼠的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化的影響。方法 用腹腔注射豬血清法制作免疫性大鼠肝纖維化模型,用劉豨逍遙五苓湯進(jìn)行預(yù)防和治療,并與秋水仙堿對(duì)照,用光鏡觀察肝臟組織學(xué)染色(HE染色)、Masson三色膠原纖維染色的變化,用電鏡觀察肝臟組織超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 中藥治療組肝臟HE染色、Masson染色及超微結(jié)構(gòu)的改善情況明顯優(yōu)于西藥對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論 劉豨逍遙五苓湯能夠保護(hù)肝細(xì)胞,減輕肝細(xì)胞變性、壞死,抑制貯脂細(xì)胞的活化和增殖,減少膠原纖維的成和分泌,阻抑肝纖維化發(fā)展。
劉豨逍遙五苓湯 肝纖維化 組織學(xué) 超微結(jié)構(gòu)
慢性乙型肝炎為臨床疑難病,病情反復(fù)發(fā)作,其中大部分合并肝纖維化,甚至進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌。本病屬中醫(yī)學(xué)“脅痛”“黃疸”“積聚”“臌脹”等范疇。近十余年來(lái),我們應(yīng)用國(guó)醫(yī)大師朱良春的劉豨逍遙五苓湯治療慢性肝炎取得良好效果[1-2]。在此基礎(chǔ)上,筆者將該方對(duì)豬血清注射法復(fù)制的大鼠肝纖維化模型的治療作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,用光鏡、電鏡觀察了纖維化大鼠的肝臟組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化?,F(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用Wistar大鼠98只 [購(gòu)于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(魯)20130019]。全部為雄性,清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn),體質(zhì)量95~105 g。大鼠的飼養(yǎng)溫度控制在20~25℃,濕度應(yīng)控制在40%~70%,飲用涼開(kāi)水。
1.2 試藥與儀器 Masson三色染色試劑盒:福州邁新生物技術(shù)公司,即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、層粘蛋白(LN)、纖維粘蛋白(FN)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京中山生物技術(shù)公司。蘇木素:美國(guó)sigma公司。伊紅:美國(guó)sigma公司。甲醛:廣州化學(xué)試劑廠。戊二醛:廣州化學(xué)試劑廠。秋水仙堿:廣東彼迪藥業(yè)有限公司。JEM-120EXDJD型透射電鏡:日本電子株式會(huì)社,高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng):法國(guó)VL公司。光學(xué)顯微鏡:西德OPTN-Ⅲ。劉豨逍遙五苓湯,組方:劉寄奴20 g,豨薟草30 g,柴胡12 g,赤芍30 g,郁金12 g,當(dāng)歸10 g,丹參30 g,莪術(shù)12 g,蒼術(shù)12 g,土茯苓30 g,茵陳15 g[3]。中藥購(gòu)于廣東一方制藥有限公司。
1.3 分組與造模 98只大鼠正常狀態(tài)下喂養(yǎng)1周,將所有大鼠編號(hào),隨機(jī)分為7組:每組14只。包括正常組、模型1組、模型2組、中藥預(yù)防組、中藥治療組、西藥預(yù)防組、西藥治療組。模型制作參照于世瀛等[4]的腹腔注射豬血清法制作肝纖維化大鼠模型。從濱州市肉聯(lián)廠購(gòu)買(mǎi)豬血,離心提取血清,保存于冰箱冷藏室中備用。正常組予0.9%氯化鈉注射液0.5 mL腹腔注射,其余各組均取0.5 mL豬血清大鼠腹腔內(nèi)注射,每周2次,正常組一半的大鼠、模型1組、中藥預(yù)防組、西藥預(yù)防組大鼠連續(xù)注射5周,其余各組連續(xù)注射10周。
1.4 給藥方法 劉豨逍遙五苓湯水煎濃縮制成相當(dāng)于每毫升藥液含3 g生藥的濃度(即300 g中藥,煎取100 mL藥液)。中藥預(yù)防組、西藥預(yù)防組及模型1組于造模同時(shí)開(kāi)始給藥。中藥預(yù)防組按3 g生藥/100 g體質(zhì)量予劉豨逍遙五苓湯灌胃,西藥預(yù)防組按0.02 mg/ 100 g體質(zhì)量予秋水仙堿灌胃,模型1組給以等量自來(lái)水灌胃,均連續(xù)35 d。中藥治療組、西藥治療組及模型2組于造模第36日開(kāi)始分別給予劉豨逍遙五苓湯、秋水仙堿及自來(lái)水灌胃,劑量、方式、時(shí)間同前。
1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)[5]1)光鏡觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化、膠原纖維增生情況及肝組織超微結(jié)構(gòu)變化:第一次取材,造模35 d后,正常組一半,模型1組,中藥預(yù)防組和西藥預(yù)防組大鼠分別斷頭處死,剖開(kāi)腹腔,暴露肝臟,切取距邊緣3 mm處肝組織,體積約0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm,用10%的中性甲醛固定24 h,酒精逐級(jí)脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚約5 μm,脫蠟到水,HE染色。采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)LN、FN,光鏡觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化及膠原纖維增生情況。另外取體積約1 mm×1 mm×2 mm的肝組織,用2.5%戊二醛前固定2~4 h,1%鋨酸后固定1.5 h;用丙酮逐級(jí)脫水,812樹(shù)脂包埋,電鏡切片厚度約60 nm,用醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色,然后用JEM-120EXDJD型透射電鏡觀察肝組織的超微結(jié)構(gòu)的變化[6]。造模70 d后,正常組剩余大鼠,模型2組,中藥治療組和西藥治療組取材處理、染色、觀察方法與第一次取材相同。2)各組膠原含量比較:病理組織切片Masson三色膠原染色[7],膠原陽(yáng)性著色呈紅色,肝臟背景為淡黃色,用圖像分析儀處理,測(cè)量均用低倍鏡(16×12),隨機(jī)選擇6個(gè)匯管區(qū)進(jìn)行染色膠原的定量分析,測(cè)量數(shù)據(jù)取均值。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠一般情況 本研究應(yīng)用腹腔注射豬血清法制作肝纖維化大鼠模型,基本不影響大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng),大鼠毛發(fā)光澤,一般活動(dòng)狀態(tài)良好,體質(zhì)量變化不大,各組動(dòng)物之間外觀無(wú)明顯差異[8]。共有5只大鼠在灌胃時(shí)不慎嗆死:模型1組、西藥預(yù)防組、西藥治療組各1只,模型2組2只。
2.2 各組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化及膠原纖維增生情況 見(jiàn)圖1,圖2。1)肝組織結(jié)構(gòu)變化。正常組肝小葉間沒(méi)有明顯的纖維間隔,肝細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)肝細(xì)胞變性、壞死。模型2組肝組織內(nèi)纖維組織增生比較明顯,有些部位形成纖維間隔,正常的肝臟小葉結(jié)構(gòu)被改建,形成典型的假小葉,有不少肝細(xì)胞腫脹變性、壞死、細(xì)胞質(zhì)變得空泡狀,伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說(shuō)明動(dòng)物肝纖維化模型制作成功。中藥治療組肝臟的組織結(jié)構(gòu)接近正常,匯管區(qū)纖維組織增生比較少,沒(méi)有形成明顯的纖維間隔,肝細(xì)胞變性較輕。中藥預(yù)防組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常,纖維組織增生不明顯;西藥治療組纖維間隔形成,分割肝小葉,但纖維組織增生的程度輕于模型組,有部分變性、壞死的肝細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥預(yù)防組纖維組織增生比較明顯,但比模型組的纖維間隔量少且相對(duì)細(xì)一些,小葉結(jié)構(gòu)基本完整。2)肝組織膠原纖維增生情況Masson三色膠原染色,膠原陽(yáng)性著色呈紅色,肝臟背景為淡黃色,正常組膠原纖維含量較少,模型組有大量膠原纖維增生,中藥治療組膠原纖維增生較少。
圖1 各組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)變化(HE染色,200倍)
圖2 各組大鼠膠原纖維增生情況(Masson三色膠原染色,100倍)
2.3 各組大鼠肝組織中LN、FN分布情況 見(jiàn)圖3,圖4。正常組LN在肝臟內(nèi)主要分布于基膜,在匯管區(qū)分布于血管和膽管以及中央靜脈周?chē)⑶已馗胃]周隙的外側(cè)均勻排布。模型2組LN增生比較明顯,在基膜和纖維間隔中分布,在血管壁上也可以見(jiàn)到LN分布,中藥治療組和中藥預(yù)防組LN的增生明顯輕于模型組,西藥治療組和西藥預(yù)防組LN有明顯的增加。正常組FN主要分布于肝血竇壁內(nèi)側(cè)以及匯管區(qū)的間質(zhì)中。模型組FN增生的量比較大,在纖維間隔及匯管區(qū)比較明顯,有許多FN陽(yáng)性細(xì)胞分布于間質(zhì)中,F(xiàn)N也分布于在肝竇壁外側(cè)。
圖3 各組大鼠肝組織LN分布情況(SABC染色,200倍)
圖4 各組大鼠肝組織FN分布情況(SABC染色,200倍)
2.4 各組膠原、LN、FN含量比較 見(jiàn)表1。各組膠原、LN、FN含量比較,模型組與正常組相比有顯著差異(P<0.01),中藥治療組與西藥治療組相比差異明顯(P<0.01)。
表1 各組大鼠膠原、LN、FN含量比較(±s)
表1 各組大鼠膠原、LN、FN含量比較(±s)
與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥治療組比較,△△P<0.01。
組別 n FN(MOD)正常組 14 28.76±4.89模型組 25 327.23±46.65**中藥預(yù)防組 14 33.31±6.87##膠原 LN(MOD)24.35±6.57 34.58±4.95 185.64±30.56**317.24±39.45**30.25±6.31##39.85±6.25##中藥治療組 14 37.24±9.75*△△36.58±8.29*△△40.51±6.87*△△西藥預(yù)防組 13 47.06±9.32**##72.32±22.81**##110.23±17.74**##西藥治療組 13 100.93±23.81**##191.35±34.63**##176.97±29.38**##
2.5 電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察 見(jiàn)圖5。正常組大鼠肝臟超薄組織切片在透射電鏡下觀察,線粒體分布比較均勻,呈現(xiàn)為橢圓形或圓形或,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比較多,呈現(xiàn)平行排列,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對(duì)比較少,細(xì)胞核大并且比較圓,可以見(jiàn)到細(xì)胞核仁較多,部分細(xì)胞有雙核。模型組肝細(xì)胞變性、壞死比較多,細(xì)胞之間的縫隙相對(duì)變寬,線粒體不規(guī)則變形,表現(xiàn)為腫脹、有一部分線粒體的嵴變窄變細(xì)、甚至消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少相對(duì)比較明顯、結(jié)構(gòu)出現(xiàn)擴(kuò)張、部分顆粒脫失,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生比較明顯,糖原顆粒與正常組相比有所減少,有些核仁消失,細(xì)胞核固縮,內(nèi)皮細(xì)胞之間窗孔出現(xiàn)基膜樣物質(zhì),并且逐漸封閉,肝竇壁變成連續(xù)性,肝竇逐漸變成毛細(xì)血管化,有大量纖維束分布于肝竇內(nèi),呈現(xiàn)交織排列,貯脂細(xì)胞外形增大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器增多而脂滴減少,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞。中藥治療組大鼠肝臟竇周隙膠原纖維增生比較少,肝細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比較多,線粒體相對(duì)比較豐富,糖原顆粒增多比較明顯,肝細(xì)胞變性比較少見(jiàn)。中藥預(yù)防組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。西藥治療組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒與中藥組比較減少明顯,膠原纖維束出現(xiàn)于匯管區(qū)及竇周隙有,表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化,肝細(xì)胞變形比較多見(jiàn),成纖維細(xì)胞、貯脂細(xì)胞增加比較明顯。西藥預(yù)防組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)基本正常,肝竇周隙膠原纖維束相對(duì)比較少。
圖5 各組大鼠超微結(jié)構(gòu)觀察
各種原因引起的慢性肝病都具有炎癥、壞死和纖維化的病理特征。肝臟纖維組織增生是慢性肝炎、肝硬化的基本病理改變之一[9],治療慢性肝炎肝纖維化,中醫(yī)藥以活血化瘀、疏肝利膽、補(bǔ)氣健脾等法為主治療該病,有比較明顯的療效,并且積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。
朱良春先生為首屆國(guó)醫(yī)大師,在肝病治療方面有獨(dú)到的經(jīng)驗(yàn),朱老認(rèn)為肝郁脾濕久結(jié)不解,肝膽疏泄失常,至黃疸日久不退,多瘀阻肝膽,宜解郁疏肝、以通絡(luò)和營(yíng)[3]。其用茵陳五苓散配合局方逍遙散加減,創(chuàng)立劉豨逍遙五苓湯,用以治療慢性肝病取得良好效果。方中劉寄奴配合豨薟草,一溫一寒,寒溫相佐,其配伍可熱可寒,可氣可血,可降酶退黃,可活血解毒,可化瘀平肝,可散結(jié)消瘕,更有統(tǒng)治肝性黃疸之功[10],為方中之主藥,為該方之特色配伍。柴胡、郁金解郁疏肝;蒼術(shù)、土茯苓健脾祛濕;茵陳、澤瀉清肝利膽退黃;赤芍、丹參、莪術(shù)、當(dāng)歸活血養(yǎng)血[11-12];生麥芽消食和胃、且有利膽退黃之用,全方配伍得當(dāng),切中病機(jī),故能取得很好的治療效果。現(xiàn)代藥理研究證明,劉寄奴濃縮煎液可使醋酸棉酚引起的大鼠高血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯下降,對(duì)麻醉犬和大鼠有明顯利膽作用。劉寄奴總生物堿和總黃酮均能防治醋酸棉酚肝損害引起的大鼠高谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶[13]。朱老善用豨薟草治療黃疽型肝炎,認(rèn)為此證多系濕熱摶于血分所致,若遷延時(shí)日,瘀熱膠結(jié)難解,一般利濕退黃之劑,殊難中的,必須涼血活血,解毒護(hù)肝始為合拍,凡黃疽纏綿不退,濕熱疫毒稽留,朱老每從血分取法,以豨薟草配合丹參、劉寄奴等,多能應(yīng)驗(yàn)[14]。柴胡皂苷能使半乳糖所致的肝功能與組織損傷恢復(fù),對(duì)四氯化碳引起的小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn),可見(jiàn)過(guò)氧化質(zhì)含量降低,肝臟中谷胱甘肽含量升高,而血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量下降[15];丹參可明顯減輕肝壞死和炎癥反應(yīng),經(jīng)丹參治療的肝纖維化動(dòng)物,肝纖維化較對(duì)照組明顯減輕。大量文獻(xiàn)報(bào)道:赤芍、郁金、當(dāng)歸、茵陳、白術(shù)、茯苓等藥有促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù),降低轉(zhuǎn)氨酶,減輕肝臟膠原纖維增生的作用。
用豬血清腹腔注射法復(fù)制大鼠肝纖維化動(dòng)物模型,該模型與其他模型比較,具有周期短、經(jīng)濟(jì)、方法簡(jiǎn)單、整體損傷輕、肝纖維化出現(xiàn)率高等特點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)中藥預(yù)防組大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)接近正常,血液循環(huán)沒(méi)有改建,纖維組織增生不明顯,肝細(xì)胞變性、壞死比較輕微;中藥治療組肝細(xì)胞變性壞死與西藥組相比明顯減少,纖維組織增生相對(duì)比較輕,貯脂細(xì)胞、成纖維細(xì)胞比西藥組明顯減少。秋水仙堿治療肝纖維化也有一定的作用,但西藥治療組大鼠肝臟組織內(nèi)膠原纖維的含量與中藥治療組相比明顯增多。Masson三色膠原染色,經(jīng)圖像分析儀做半定量分析處理后,模型組肝組織內(nèi)膠原纖維的含量是正常組的7.59倍,西藥治療組是正常組的4.14倍,中藥治療組是正常組的1.5倍,中藥治療組與西藥治療組相比,療效明顯,兩組有非常顯著性差異。肝組織內(nèi)非膠原糖蛋白主要有FN及LN,肝纖維化時(shí)FN作用于肝細(xì)胞,使之分泌膠原,并且也可以使成纖維細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增生,分泌細(xì)胞外基質(zhì),使纖維化繼續(xù)發(fā)展。LN是基底膜的主要組成成分,肝纖維化時(shí)其形成增加,其含量增加與肝竇毛細(xì)血管化,也就是與肝纖維化的不可逆性有關(guān)[5],模型組FN和LN明顯增多,中藥治療組,F(xiàn)N與LN的增生相對(duì)比較少,中藥治療組與西藥治療組比較有顯著差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:劉豨逍遙五苓湯能夠保護(hù)肝細(xì)胞,減輕致病因素引起的肝細(xì)胞變性和壞死,促進(jìn)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù);能夠抑制貯脂細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及增殖,減輕纖維組織及非膠原糖蛋白的合成以及分泌,促使肝纖維化進(jìn)展減慢或者逆轉(zhuǎn)。
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Effect of Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction on Histopathology and Ultrastructure of Hepatic Fibrosisin Rats
JIANG Yiming,JIANG Xuelian,LIU Xinjun,et al.Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Shandong,Binzhou 256600,China.
Objective:To observe the changes of histopathology and ultrastructure of Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction on hepatic fibrosis in rats.Methods:The immunohepatic fibrosis model was induced by intraperitoneal injection of porcine serum,and treated and prevented with Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction,and compared with colchicine.The changes of HE and Masson of the rats′liver were observed with optic microscope;the ultrastructure was observed with electronic microscope.Results:The improvement of HE staining,Masson staining and ultrastructure of the treatment group was superior to that of the control group obviously(P<0.01).Conclusion:Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction can protect liver cells,reduce liver cell degeneration and necrosis,inhibit fat storing cell′s activation and proliferation,reduce collagen fiber formation and secretion,and inhibit the development of liver fibrosis.
Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction;Liver fibrosis;Histology;Ultrastructure
R285.5
A
1004-745X(2016)10-1877-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.013
山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2009-185)
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(2016-05-08)