響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)酶解提取米渣蛋白的研究

錢俊青，趙莉萍，范 菁，潘存麗，俞 明

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院 浙江 杭州 310014)

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響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)酶解提取米渣蛋白的研究

錢俊青1，趙莉萍2，范 菁1，潘存麗1，俞 明1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院 浙江 杭州 310014)

為改善米渣中蛋白質(zhì)的提取效果，采用中性蛋白酶酶解、堿溶兩步法提取米蛋白.固定堿提取工藝，通過單因素實驗，確定了預(yù)酶解的基本條件；并以pH和加酶量和反應(yīng)時間為自變量，蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法，對預(yù)酶解條件進行響應(yīng)面(RSM)優(yōu)化，確定了預(yù)酶解的最優(yōu)工藝.最優(yōu)條件下得到米渣蛋白質(zhì)的提取率為78.27%，質(zhì)量分數(shù)為72.86%，較直接堿提取，兩者均有了一定的提高，且以蛋白質(zhì)提取率提升幅度大，且優(yōu)化條件下的實驗結(jié)果與RSM回歸方程預(yù)測值吻合良好.

米渣；中性蛋白酶；響應(yīng)面；提取

稻谷是重要的糧食作物，我國稻谷產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的40%，居世界首位[1].米渣是工業(yè)上生產(chǎn)糖和味精的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為50%～60%，是大米的5～8倍[2].與稻米蛋白類似，米渣蛋白具有高營養(yǎng)性[3]、低過敏性、風(fēng)味溫和及不會引起腸胃脹氣等獨特性質(zhì)，許多國家將其作為嬰幼兒的蛋白補充劑[4-5]；與此同時，米渣蛋白還具有降膽固醇、降血壓、抗氧化和抗癌變等多種保健功能[6-10]，因此具有極其重要的回收利用價值，而目前我國對米渣的處理主要是用作飼料，其工業(yè)附加值低，經(jīng)濟效益差，不利于稻米的深加工.米渣蛋白中80%以上為堿溶性谷蛋白，這些蛋白分子間通過大量的二硫鍵和疏水基團進行交聯(lián)、凝聚，使得蛋白溶解性下降.目前，米渣蛋白的提取方法主要為堿法[11-12]和酶法[13-16]，其中酶法生產(chǎn)條件溫和，液固比小，蛋白質(zhì)營養(yǎng)成分保留完全，但大多數(shù)酶價格昂貴，且提取時間較長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，且直接用酶法得到的樣品糖含量一般較高，需進一步純化，生產(chǎn)成本較高[17]；堿法提取米渣蛋白，是利用堿液的高效溶解性，將米蛋白與淀粉的緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，同時破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵，解離極性基團，促進蛋白質(zhì)分子溶解，提取工藝簡單，生產(chǎn)成本低，同時堿提取的稻米蛋白乳化性較好，在工業(yè)中應(yīng)用廣泛[18]，但高濃度堿會對蛋白質(zhì)造成一定的破壞，且高固液比會產(chǎn)生大量污水，不利于綠色經(jīng)濟的發(fā)展.

為提高米渣蛋白的提取效果，降低高濃度堿的負面作用，將酶解和堿溶法相結(jié)合提取米渣蛋白.采用來源廣泛、價格便宜、穩(wěn)定性好和水解強度大，水解產(chǎn)物風(fēng)味佳的中性蛋白酶對米渣作預(yù)酶解，將結(jié)合狀態(tài)的蛋白質(zhì)分離，再利用堿法提取米蛋白.著重研究了預(yù)酶解pH值、加酶量、溫度和反應(yīng)時間4個因素對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響，并對其進行了響應(yīng)面分析法(RSM)[19-20]優(yōu)化，并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，確定了最佳酶解條件.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

米渣：杭州味精廠(水分50.19%；粗蛋白質(zhì)28.39%)；食用級中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司，活力為5. 0×104 u/g；KDY-08C(8Ⅱ)半自動凱式定氮儀；DS-1型高速組織搗碎機；PHS-3C型精密pH計；LD4-2離心機；化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 米渣蛋白的堿法提取

以蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)為指標(biāo)，單因素優(yōu)化堿法提取米渣蛋白，得到堿提取最優(yōu)條件為：固液比1∶8，pH=12.0，溫度40 ℃，提取時間4 h；此條件下得到蛋白質(zhì)的提取率和質(zhì)量分數(shù)分別為50.44%和67.32%.

1.2.2 米渣蛋白的復(fù)合提取

由于堿法直接提取米渣蛋白，得到的蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)相對不高，因此考慮堿提取前對米渣進行酶解，并進行酶解工藝優(yōu)化，基本流程為：米渣→粉碎→60目篩→酶解→堿提取→離心分離→上清液.

1.2.3 蛋白質(zhì)提取率的計算

總蛋白質(zhì)的測定參照GB/ 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，提取率=(上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量)×100%.

1.2.4 預(yù)酶解條件的單因素考察

分別稱量50 g米渣，粉碎均勻、過篩，加水至固液比為1∶7，置于不同條件下機械攪拌，分別考察酶解pH (6.0～8.0)、加酶量(200～600 u/g)、酶解溫度(30～55 ℃)、酶解時間(2～6 h)，對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響.

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)酶解提取工藝

由單因素試驗結(jié)果可知，酶解溫度對蛋白質(zhì)提取效果的影響相對不明顯，45 ℃條件下，蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)最高，因此可以固定溫度為45 ℃，對與其相關(guān)性更密切的其他因素進行優(yōu)化.采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以加酶量、酶解pH、反應(yīng)時間3個因素為自變量，分別以A，B，C表示，以蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計了3因素3水平的RSM實驗，試驗方案、條件及結(jié)果如表1，2所示.

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶解pH對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響

研究表明[21]：pH對酶的穩(wěn)定性，酶活性中心上活性基團的解離程度以及底物和輔酶的結(jié)合程度有一定的影響.固定酶解固液比1∶7，溫度45 ℃，加酶量500 u/g，酶解時間5 h，研究酶解pH對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響.由圖1(a)可見：當(dāng)pH為 6.0～7.5時，蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)增加明顯，pH>7.5，蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)趨于平穩(wěn).一方面酶的本質(zhì)決定了酶的活性部位的基團對體系pH的變化比較敏感，其解離狀態(tài)隨著pH的變化而變化，這些變化直接影響酶的構(gòu)象，影響酶對底物的催化；另一方面pH的變化也會影響米蛋白的溶解性，堿性下降，蛋白質(zhì)析出.為充分發(fā)揮酶的活力，選擇pH為7.0～8.0進行RSM優(yōu)化.

2.1.2 加酶量對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響

固定酶解pH 7.5，其他條件不變，研究加酶量對提取效果的影響.由圖1(b)可見：隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)同比升高，加酶量超過400 u/g，兩者變化趨于平緩.分析原因是當(dāng)加酶量達到一定程度后，酶與底物的作用達到飽和，更大的酶用量產(chǎn)生的作用較小.

圖1 pH和加酶量對提取效果的影響Fig.1 Effect of enzymatic pH and enzyme content on extraction

2.1.3 酶解溫度對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響

酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)，文獻表明，酶只有在最適反應(yīng)溫度時，酶活力才最大，溫度過高或過低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，酶的活力下降[22].固定加酶量400 u/g，其他條件不變，考察不同溫度對蛋白質(zhì)提取效果的影響.由圖2(a)可見：40～50 ℃范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)和提取率變化不明顯，酶解溫度45 ℃時，兩者相對最高，說明中

性蛋白酶在此反應(yīng)體系的最適溫度為45 ℃左右.

2.1.4 酶解時間對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)的影響

酶解溫度45 ℃，其他條件不變，考察不同酶解時間對蛋白質(zhì)提取效果的影響.由圖2(b)可見：隨著時間的延長，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)和提取率均明顯上升，超過4 h，兩者趨于平穩(wěn).為提高提取效率，節(jié)約成本，選擇3～5 h作進一步優(yōu)化.

圖2 溫度和時間對提取效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature and enzymatic time on extraction

2.2 RSM結(jié)果分析

由表2可見：17個實驗點，包含5個零點實驗和12個析因試驗.試驗號10～12，16～17為中心實驗，其余為析因試驗.其中零點為區(qū)域的中心點，析因點為各自變量所構(gòu)成的三維頂點，中心試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差.

運用Design-Expert 8.0對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，米渣蛋白提取率和質(zhì)量分數(shù)的回歸方程方差分析如表3，4所示，RSM3D圖像見圖3,4.各因素經(jīng)回歸擬合后，得到提取率回歸方程為：提取率=-322.913+0.318A+74.150B+16.055C-8.500×10-3AB-9.25×10-3AC+0.85BC-2.222×10-4A2-4.69B2-2.023C2；質(zhì)量分數(shù)回歸方程為：質(zhì)量分數(shù)= -519.275 + 0.216A+ 124.525B+ 37.348C+ 9.000×10-3AB+4.5×10-3AC-3.250BC-3.408×10-4A2-7.730B2-1.533C2，其中：A為加酶量；B為pH；C為反應(yīng)時間.

表2 響應(yīng)面分析及試驗結(jié)果

從表3可知：整體模型的“Prob>F”<0.05，說明建立的模型顯著，能起到較好的預(yù)測作用.另外試驗中失擬項P=0.288 5>0.05，說明模型無失擬因素存在，實驗誤差小，用該回歸方程代替真實實驗對結(jié)果進行分析準(zhǔn)確可靠.同時，由回歸方程各項方差結(jié)果可知，所有自變量和提取率線性關(guān)系顯著，其中A(加酶量)和C(酶解時間)二次項的影響顯著，交互作用中，BC(pH與酶解時間)影響顯著.以質(zhì)量分數(shù)為指標(biāo)，由表4可知：“Prob>F”<0.05，P=0.070 2>0.05，無失擬因素存在.在所選條件下，因素A，B，C對質(zhì)量分數(shù)的影響均顯著，A和B的二次項的影響顯著，交互作用中，表現(xiàn)為P>0.05，說明以蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為指標(biāo)，三因素的交互作用不明顯.

表3 蛋白提取率回歸分析結(jié)果

表4 蛋白質(zhì)量分數(shù)的回歸分析結(jié)果

2.3 最佳提取條件的確定

以蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)同時達到最高為最佳點，運用Design-Expert軟件進行RSM回歸分析，得出最佳酶解工藝條件為：加酶量456.18 u/g，pH7.52、酶解時間4.69 h；此條件下，理論預(yù)測的提取率79.93%，質(zhì)量分數(shù)75.13%.考慮實際操作的便利性，將酶解條件修正為：加酶量456 u/g，pH 7.5，酶解4.7 h，其他條件不變進行提取，得到提取率78.27%，質(zhì)量分數(shù)72.86%，理論值誤差在2%～3%，因此可確定RSA法優(yōu)化的酶解工藝準(zhǔn)確可靠.

圖3 提取率的響應(yīng)面Fig.3 Responsive surfaces of protein extraction rate

圖4 質(zhì)量分數(shù)的響應(yīng)面Fig.4 Responsive surfaces of protein mass fraction

3 結(jié) 論

采用中性蛋白酶預(yù)酶解、堿溶法提取米渣蛋白，固定堿提取工藝：固液比1∶8，pH 12.0，溫度40 ℃，提取時間4 h條件下，預(yù)酶解pH值、溫度、加酶量、反應(yīng)時間對蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分數(shù)均有影響；單因素實驗篩選出預(yù)酶解溫度為45 ℃；RSM優(yōu)化預(yù)酶解工藝，得出最優(yōu)酶解條件(加酶量456.18 u/g，pH值7.52、反應(yīng)時間4.69 h)；根據(jù)實際實驗操作的可行性，在加酶量456 u/g，pH 7.5，反應(yīng)時間4.7 h，溫度45 ℃條件下進行驗證試驗，得到米渣中蛋白質(zhì)的提取率為78.27%，蛋白質(zhì)量分數(shù)為72.86%，與直接堿提取相比，蛋白質(zhì)提取率提高了55.17%，質(zhì)量分數(shù)提高了8.23%，說明預(yù)酶解顯著提高了米渣蛋白的提取效果，且響應(yīng)值的實驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，有一定的應(yīng)用價值.

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(責(zé)任編輯：劉 巖)

Optimization on pre-enzymolysis extraction technology of rice protein from rice dregs with response surface analysis

QIAN Junqing1, ZHAO Liping2, FAN Jing1, PAN Chunli1, YU Ming1

(1.College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014, China ；2.College of Ocean Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014, China)

To improve the rice residue protein extraction, a method of extracting rice protein from rice dregs by neutral protease-dilute alkali hydrolysis was studied. Fixed alkali extraction technology, through the hydrolysis of single factor experiment, general conditions of enzymatic hydrolysis were obtained. Through Box-Behnken design, enzymolysis pH, amount of neutral protease and enzymolysis time as variables, protein extraction rate and mass fraction as response values, the optimum hydrolysis conditions of enzymes were investigated with response surface method. Under the optimal conditions, the protein yield was 78.27%, protein content was 72.86%. Compared with the results of alkaline extraction, they both have increased, especially for the protein extraction rate. Further more, the results were consistent with the predicted values, implying that the method has certain practical value.

rice dreg; neutral proteinase; response surface method; extraction

2016-03-01

錢俊青(1965—)，男，浙江杭州人，教授，研究方向為生藥資源開發(fā)與利用，E-mail：qjq@zjut.edu.cn.

TS212

A

1006-4303(2016)05-0505-05