金柑多糖微波輔助提取工藝優(yōu)化及抑菌效果

曾紅亮黃燦燦 常 青許文彥 張 怡 鄭寶東

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

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金柑多糖微波輔助提取工藝優(yōu)化及抑菌效果

曾紅亮1,2黃燦燦1常 青1許文彥1張 怡1,2鄭寶東1,2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

為了研究金柑多糖微波輔助提取的最佳工藝及其抑菌效果，試驗(yàn)在考察單因素對(duì)多糖得率影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)金柑多糖微波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)金柑多糖抑菌效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，金柑多糖最佳的微波輔助提取工藝條件為：微波功率460 W，微波時(shí)間8.4 min，液料比38∶1(mL/g)，粒徑60目，在該條件下，多糖得率為(5.55±0.13)%，與理論預(yù)測值基本一致。相比水提法和超聲波強(qiáng)化法，微波輔助法的多糖得率分別提高了207.20%和33.73%。金柑多糖抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞桿菌等菌的最小抑菌濃度分別為3.13，50.00，12.50，12.50，12.50 mg/mL。微波輔助提取法是一種高效的提取金柑多糖的方法，所得多糖對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑制效果。

金柑；多糖；微波輔助提取；抑菌效果

金柑(Fortunella margarita (Lour.)Swingle)，也稱金桔、綠桔、金彈桔、金棗，原產(chǎn)于中國華南地區(qū)，在歐洲、日本、美國、巴西、澳大利亞、南非和印度等地區(qū)有著廣泛種植[1]。中國主要的金柑分布區(qū)域?yàn)檎憬眮隹h、江西遂川縣、湖南瀏陽縣、廣西陽朔縣和融安縣、福建尤溪縣等[2]。其中尤溪縣是中國金柑的五大產(chǎn)區(qū)之一，作為“中國金柑之鄉(xiāng)”，已有370多年栽培歷史[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[4]，2015年尤溪金柑種植面積為2 647hm2，總產(chǎn)量達(dá)4萬t。目前，金柑主要以鮮食為主，加工產(chǎn)品較少，主要有：果汁、果酒、果醬和果脯等，其深加工相對(duì)薄弱，有關(guān)金柑中活性成分的研究較少[5-8]。

金柑中的主要活性成分之一是金柑多糖。前期研究[9]表明，金柑多糖能夠容納水，黏性強(qiáng)，可作為一種天然的食品增稠劑；對(duì)于羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基，具有一定的清除作用[10]；具有一定的胰脂肪酶活性抑制作用、膽酸鹽結(jié)合能力等體外降血脂活性[11]。尋找高得率且具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力的提取方法對(duì)其理化性質(zhì)和生理活性的研究至關(guān)重要。采用一般熱水浸提法提取金柑多糖，比較耗時(shí)且得率低[12]；采用酸堿溶劑提取法容易導(dǎo)致金柑多糖結(jié)構(gòu)的破壞，不利于其功能活性和構(gòu)效關(guān)系的研究[13]；微波輔助法提取多糖具有操作簡單和純度高等優(yōu)點(diǎn)，有利于后續(xù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究。

目前，僅見采用熱水浸提法、超聲波強(qiáng)化法、堿溶劑提取法提取金柑多糖，多糖得率低，且可能會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的破壞[13]；而采用微波輔助法提取金柑多糖，操作簡單，得率高。因此，本研究采用微波輔助法提取金柑多糖，在單因素對(duì)多糖得率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究不同濃度金柑多糖分別對(duì)5種菌抑制作用的影響，以期為金柑多糖結(jié)構(gòu)特性、功能學(xué)特性及其應(yīng)用研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮尤溪金柑：九成熟，由尤溪縣農(nóng)業(yè)局提供；

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞桿菌：由福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；

無水乙醇為分析純；

試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

微波爐：EG823LC8-NS型，廣東省佛山市美的電子科技有限公司；

植物粉碎機(jī)：XFB-400型，長沙市雨花區(qū)中誠制藥機(jī)械廠；

臺(tái)式低速離心機(jī)：TD4型，鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，上海比郎儀器制造有限公司；

壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-100A型，濟(jì)南捷島分析儀器有限公司；

電熱恒溫真空干燥箱：DZ80型，上海南匯老港機(jī)械廠；

數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：HPX-9082ME型，上海博迅事業(yè)有限公司；

電子數(shù)顯外徑千分尺：I型，上海量具刃具廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金柑粉末樣品的制備 參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.2 提取流程

金柑粉末樣品→微波輔助提取→離心→上清液→減壓濃縮→醇析離心→沉淀→凍干→測定

1.3.3 多糖得率的測定 多糖得率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

m1——多糖質(zhì)量，mg；

m2——樣品質(zhì)量，mg；

1.3.4 單因素試驗(yàn)

(1) 微波功率對(duì)多糖得率的影響：取80目粒徑試驗(yàn)樣品10 g，置于錐形瓶中，以30∶1(mL/g)比例加入蒸餾水，分別在微波功率100，200，300，400，500，600，700 W條件下，提取4 min，在5 000 r/min條件下將提取液離心10 min，將上清液在真空度為0.09 MPa、溫度60 ℃條件下，減壓濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積的80%乙醇沉降20 h，離心得多糖沉淀，將沉淀在真空度小于20 Pa條件下凍干20 h后，得到金柑多糖粉末，稱重。

(2) 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響：取80目粒徑試驗(yàn)樣品10 g，置于錐形瓶中，以30∶1(mL/g)比例加入蒸餾水，在微波功率400 W條件下，分別提取2，4，6，8，10，12，14 min，在5 000 r/min條件下將提取液離心10 min，將上清液在真空度為0.09 MPa、溫度60 ℃條件下，減壓濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積的80%乙醇沉降20 h，離心得多糖沉淀，將沉淀在真空度小于20 Pa條件下凍干20 h后，得到金柑多糖粉末，稱重。

(3) 液料比對(duì)多糖得率的影響：取80目粒徑試驗(yàn)樣品10 g，置于錐形瓶中，分別以10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1(mL/g)比例加入蒸餾水，在微波功率400 W條件下，提取8 min，在5 000 r/min條件下將提取液離心10 min，將上清液在真空度為0.09 MPa、溫度60 ℃條件下，減壓濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積的80%乙醇沉降20 h，離心得多糖沉淀，將沉淀在真空度小于20 Pa條件下凍干20 h后，得到金柑多糖粉末，稱重。

(4) 粒徑對(duì)多糖得率的影響：分別取粒徑20，40，60，80，100目試驗(yàn)樣品10 g，置于錐形瓶中，以40∶1(mL/g)比例加入蒸餾水，在微波功率400 W條件下，提取8 min，在5 000 r/min條件下將提取液離心10 min，將上清液在真空度為0.09 MPa、溫度60 ℃條件下，減壓濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積的80%乙醇沉降20 h，離心得多糖沉淀，將沉淀在真空度小于20 Pa條件下凍干20 h后，得到金柑多糖粉末，稱重。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法研究微波功率、微波時(shí)間、液料比和粒徑對(duì)多糖得率的影響，獲得微波輔助提取金柑多糖的回歸方程和最佳工藝參數(shù)。

1.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測的微波輔助提取金柑多糖最佳工藝條件，測定金柑多糖的實(shí)際得率，比較預(yù)測值和實(shí)際值，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.3.7 抑菌試驗(yàn)

(1) 不同濃度多糖溶液的制備：用蒸餾水分別將金柑多糖配制成濃度為100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78 mg/mL的溶液，備用。

(2) 培養(yǎng)基的制備：取平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5 g加熱攪拌溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝錐形瓶，121 ℃高壓滅菌15～20 min，備用。

(3) 菌種的活化和菌液的制備：參照文獻(xiàn)[14]50。

(4) 抑菌試驗(yàn)：準(zhǔn)備若干牛津杯(直徑6 mm)于121 ℃滅菌20 min，備用。將已滅菌的固體培養(yǎng)基熔化后倒入培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，用移液槍分別加入1 mL菌懸液，用無菌涂布棒涂布均勻，做成含菌平板。用滅菌鑷子將無菌牛津杯放在培養(yǎng)基上，每皿放3個(gè)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。以無菌水作為對(duì)照。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑大小。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)多糖提取數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并對(duì)模型進(jìn)行顯著性分析；采用DPS 9.05對(duì)抑菌效果數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由單因素試驗(yàn)可知：微波功率選擇400 W為宜、微波時(shí)間選擇8 min為宜、液料比選擇40∶1(mL/g)為宜和粒徑選擇60目為宜。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波功率、微波時(shí)間、液料比和粒徑為自變量，采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素5水平試驗(yàn)，以多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。各試驗(yàn)因素和水平見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2 模型的建立及顯著性分析

采用Design-Expert 軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各項(xiàng)的顯著性分析，并建立提取模型，分析結(jié)果見表3。

表1 因素和水平表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)金柑多糖得率的影響程度依次為：微波功率>液料比>粒徑>微波時(shí)間。

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到金柑多糖得率對(duì)微波功率、微波時(shí)間、液料比和粒徑4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=5.490 0+0.163 3A-0.086 7C+0.061 7D+0.272 5AB-0.125 0AC+0.307 5AD-0.195 0BD+0.257 5CD-0.245 6A2-0.376 9B2-0.245 7C2-0.375 6D2。

(2)

2.3 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

由以上方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)金柑多糖得率的影響依次為：A>C>D>B。A、B、C和D二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，方程表示的拋物面開口向下有極大值點(diǎn)。

表3 方差分析表?

綜合圖1～6可知，微波功率和微波時(shí)間交互作用、微波功率和液料比交互作用、微波功率和粒徑交互作用、微波時(shí)間和粒徑交互作用、液料比和粒徑交互作用對(duì)金柑多糖得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡；而微波時(shí)間和液料比交互作用對(duì)金柑多糖得率的影響不顯著，表現(xiàn)為曲面較為平滑。這與方差分析的結(jié)果一致。在微波功率和微波時(shí)間、微波功率和液料比、微波功率和粒徑交互作用中，當(dāng)其他因素固定的條件下，多糖得率起初隨著微波功率的增大而增大，當(dāng)微波功率超過一定值時(shí)，多糖得率隨著微波功率的增大而降低。這可能是剛開始隨著微波功率的增大，由于微波加熱的高效性，細(xì)胞破壁效果增強(qiáng)，有助于多糖的溶出；但當(dāng)微波功率超過一定值時(shí)，多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞，水解程度加大，多糖得率降低[15-16]。在微波時(shí)間和粒徑、液料比和粒徑交互作用中，當(dāng)其他因素固定時(shí)，多糖得率剛開始隨著粒徑的減小而增大，當(dāng)粒徑小于一定值時(shí)，多糖得率隨著粒徑的減小而降低。這可能是一定大小的粒徑有利于金柑粉末與溶液的充分接觸，提高多糖得率；當(dāng)粒徑太小時(shí)，金柑粉末在水中形成粘稠狀，不利于微波的提取，多糖得率降低[14]29。

2.4 工藝確定及與其他方法的比較

結(jié)合回歸模型，由Design-Expert 8.0.6軟件分析得到金柑多糖最佳的微波輔助提取工藝條件為：微波功率462.48 W，微波時(shí)間8.36 min，液料比37.77∶1(mL/g)，粒徑64.26目，在此條件下，多糖得率為5.56%?？紤]到實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件修正為：微波功率460 W，微波時(shí)間8.4 min，液料比38∶1(mL/g)，粒徑大小60目，在此條件下，采用最佳微波輔助提取工藝提取金柑多糖3次，多糖得率平均值為(5.55±0.13)%，與理論預(yù)測值基本一致，這說明回歸模型具有可靠性。金柑多糖實(shí)際值與預(yù)測值的線性關(guān)系見圖7，其實(shí)際值與回歸模型預(yù)測值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，說明模型的預(yù)測值能較好地反應(yīng)微波輔助提取法的實(shí)際金柑多糖得率。

圖1 微波功率與微波時(shí)間對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖2 微波功率與液料比對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖3 微波功率與粒徑對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖4 微波時(shí)間與液料比對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖5 微波時(shí)間與粒徑對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

前期研究表明，采用熱水浸提法和超聲波強(qiáng)化法，金柑多糖得率分別為(1.81±0.01)%[12]和(4.15±0.11)%[10]。不同提取方法對(duì)金柑多糖得率的影響見圖8，相比水提法和超聲波強(qiáng)化法，采用微波輔助法提取金柑多糖，得率分別提高了207.20%和33.73%。采用微波輔助法提取金柑多糖，時(shí)間短、多糖得率高。

圖6 液料比與粒徑對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 實(shí)際值與預(yù)測值的線性關(guān)系圖

圖8 不同提取方法對(duì)金柑多糖得率的影響

Figure 8 Effect of different extraction methods on the yield of polysaccharide fromFortunellamargarita(Lour.) Swingle

2.5 金柑多糖的抑菌效果

由表4可知，隨著多糖濃度的降低，金柑多糖對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸減低，多糖濃度6.25 mg/mL時(shí)的抑菌作用與多糖濃度3.13 mg/mL時(shí)無顯著差異；隨著濃度的降低，金柑多糖對(duì)于沙門氏菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用逐漸降低，且各多糖濃度之間抑菌效果差異顯著；金柑多糖對(duì)假單胞桿菌的抑菌作用隨著濃度的降低而降低，多糖濃度25 mg/mL和12.5 mg/mL之間抑菌作用差異不顯著。金柑多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞桿菌等菌具有抑制作用的最小抑菌濃度分別為3.13，50.00，12.50，12.50，12.50 mg/mL。抑菌效果大小為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>假單胞桿菌>沙門氏菌，其中，金柑多糖對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑制效果。

3 結(jié)論

金柑多糖最佳的微波輔助提取工藝參數(shù)為：微波功率460 W，微波時(shí)間8.4 min，液料比38∶1(mL/g)，粒徑60目，在此條件下，多糖得率為(5.55±0.13)%，與理論預(yù)測值基本一致。相比水提法和超聲波強(qiáng)化法，采用微波輔助法提取金柑多糖，得率分別提高了207.20%和33.73%。這表明微波輔助提取法是一種較高效的提取金柑多糖的方法。抑菌效果結(jié)果表明，金柑多糖表現(xiàn)出了一定的抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞桿菌等菌生長的作用，其最小抑菌濃度分別為3.10，50.00，12.50，12.50，12.50 mg/mL。金柑多糖可作為一種潛在的食品抑菌劑。微波可能會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，這與微波輔助提取工藝參數(shù)有關(guān)；而這種結(jié)構(gòu)的變化與多糖生物活性(如：抑菌效果)之間的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表4 金柑多糖濃度對(duì)抑菌效果的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)；ND表示該濃度下無抑菌效果。

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Optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharide from Fortunella margarita (Lour.) Swingle and its antibacterial effect

ZENG Hong-liang1,2HUANGCan-can1CHANGQing1XUWen-yan1ZHANGYi1,2ZHENGBao-dong1,2

(1.CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujia350002,China;2.FujianProv-incialKeyLaboratoryofQualityScienceandProcessingTechnologyinSpecialStarch,Fuzhou,Fujian350002,China)

In order to investigate the optimum technology of microwave-assisted extraction of polysaccharide fromFortunellamargarita(Lour.) Swingle and its antibacterial abilities, the effects of single factors on the yield of polysaccharide were evaluated in this paper. On the basis of these single factor experiments, the extraction technology was optimized by response surface methodology, and then its antibacterial effect was studied. The results showed that the optimum technology conditions were as follows: microwave power of 460 W, microwave time of 8.4 min, ratio of water volume to raw material weight (W/M ratio) of 38 mL/g and particle size of 60 mesh sieve. Under these conditions, the yield of polysaccharides was (5.55±0.13)%, consistent with the theoretical value. Comparing with the hot water and ultrasonic-assisted extraction method, it increased by 207.20% and 33.73%, respectively. Furthermore, the minimal inhibitory concentrations of polysaccharide againstStaphyloccocusaureusRosenbach,Salmonella,Escherichiacoli,Bacillussubtilis, andPseudomonaswere 3.13, 50.00, 12.50, 12.50 and 12.50 mg/mL, respectively. Microwave-assisted extraction was an attractive method for extracting polysaccharide fromFortunellamargarita(Lour.)Swinglewith high efficiency and the polysaccharide displayed a good antibacterial effect onStaphyloccocusaureusRosenbach.

Fortunella margarita (Lour.)Swingle;polysaccharide;microwave-assistedextraction;antibacterialeffect

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2016J05068)

曾紅亮，男，福建農(nóng)林大學(xué)講師，博士。

鄭寶東(1967—)，男，福建農(nóng)林大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。

E-mail:zbdfst@163.com

2016-05-01