提取液及固-液分離方法對固態(tài)非淀粉多糖酶類活性的影響

廖　?！≮w　峰　齊智利　張宏福

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢430070)

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提取液及固-液分離方法對固態(tài)非淀粉多糖酶類活性的影響

廖睿1,2趙峰1*齊智利2*張宏福1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢430070)

本試驗(yàn)旨在探討固態(tài)酶制劑評估中酶的適宜提取液及固-液分離方法。采用4×3雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中提取液分別為去離子水、乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 5.50)、磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.00)和0.9%NaCl溶液；溶液提取后的固-液分離方法分別為不分離、3 000 r/min離心3 min和中速濾紙過濾。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)2個(gè)平行，測定各個(gè)處理下酶的活性，并考察提取液的類型對酶制劑產(chǎn)品(α-半乳糖苷酶除外)溶解離心后溶液中溶質(zhì)及蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，磷酸鹽緩沖液溶解木聚糖酶后活性最高(P<0.05)；乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液及0.9%NaCl溶液溶解β-葡聚糖酶后活性相當(dāng)(P>0.05)，且均顯著地高于去離子水(P<0.05)；去離子水溶解β-甘露聚糖酶后活性最高，其次為乙酸-乙酸鈉緩沖液，兩者都顯著地高于磷酸鹽緩沖液和0.9%NaCl溶液(P<0.05)。提取液類型對α-半乳糖苷酶活性無顯著影響(P>0.05)。酶制劑溶解后的固-液分離方法對木聚糖酶的測定活性無顯著性影響(P>0.05)；提取液離心或過濾后β-葡聚糖酶活性最高(P<0.05)；提取液離心后β-甘露聚糖酶活性最高(P<0.05)；而提取液不分離時(shí)α-半乳糖苷酶的活性最高(P<0.05)。提取液的種類和酶制劑溶解后的固-液分離方法對4種非淀粉多糖酶的測定活性有極顯著的交互作用(P<0.01)。乙酸-乙酸鈉緩沖液對木聚糖酶制劑的溶解度最大(P<0.05)，去離子水和0.9%NaCl溶液均對β-葡聚糖酶及β-甘露聚糖酶制劑的溶解度最大(P<0.05)。然而，乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶后提取液中蛋白質(zhì)的含量均最低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解4種固態(tài)酶制劑可以最有效地將酶蛋白提取出來，α-半乳糖苷酶提取后不宜固液分離，而其他3種酶的提取液適宜進(jìn)行離心分離。

非淀粉多糖酶；提取液；固-液分離；酶活性

國內(nèi)市場上飼用非淀粉多糖酶制劑產(chǎn)品多以載體吸附發(fā)酵酶液的固態(tài)形式存在。在評估固態(tài)飼用酶制劑產(chǎn)品的酶學(xué)特性及其對飼料原料的水解效應(yīng)中，所有反應(yīng)均在液相中進(jìn)行。通過提取液從固態(tài)酶制劑中浸出飼用酶是開展酶活性評估首先需要考慮的問題，因此，探討適合固態(tài)飼用酶的提取液及溶解后固-液分離方法非常重要。目前，在飼用非淀粉多糖酶活性的測定中，對固態(tài)酶制劑多采用乙酸-乙酸鈉緩沖液提取，并通過離心的方法分離提取酶液與不溶物[1]。而在飼用酶制劑效應(yīng)的體外消化評定中，酶制劑的添加方式有2種：第1種為直接加入飼糧中，適合于少量樣品中加入液體酶制劑或批量配制飼糧時(shí)添加固態(tài)酶制劑[2-3]；第2種為通過溶液浸提固態(tài)酶制劑后離心取上清液加入反應(yīng)體系中，適合于在少量飼料樣品的條件下均勻地加入飼用酶[4]。然而，從固態(tài)酶制劑中浸提飼用酶時(shí)，緩沖液的種類、固-液分離方法對測定樣品的酶活性均有影響[5-6]。由此可見，在固態(tài)酶制劑的評估中，探討合適的提取液及固-液分離方法非常關(guān)鍵。為此，本研究分別探討了提取液與經(jīng)溶液提取后的固-液分離方法對酶活性測定值的影響以及提取液的類型對酶制劑產(chǎn)品溶解后溶液中溶質(zhì)及蛋白質(zhì)含量的影響，以篩選適宜的提取液及固-液分離方法，為飼用酶制劑產(chǎn)品評估中的前處理提供參考。

1　材料與方法

1.1飼用酶制劑產(chǎn)品

飼用酶制劑產(chǎn)品由北京某生物技術(shù)有限公司提供，其酶學(xué)特性列于表1。

表1　飼用酶制劑產(chǎn)品的特性

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分為2個(gè)部分。其中試驗(yàn)1考察飼用酶制劑的提取液及經(jīng)溶液提取后的固-液分離方法對酶活性測定值的影響。采用4×3雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中提取液設(shè)4個(gè)處理，分別為去離子水、乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 5.50)、磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.00)及0.9%NaCl溶液，溶解時(shí)間30 min；3種溶液提取后的固-液分離方法分別為不分離、3 000 r/min離心3 min和中速定量濾紙過濾。共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)2個(gè)平行，測定各個(gè)處理下4種酶制劑的活性。試驗(yàn)2根據(jù)試驗(yàn)1的結(jié)果，即在3 000 r/min離心3 min分離提取液與酶制劑固體不溶物(α-半乳糖苷酶除外)的條件下，進(jìn)一步考察提取液的類型對酶制劑產(chǎn)品溶解后溶液中溶質(zhì)及蛋白質(zhì)含量的影響，以確定溶液中雜質(zhì)的含量。提取液設(shè)4個(gè)處理，分別為去離子水、乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 5.50)、磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.00)及0.9%NaCl溶液，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)2個(gè)平行，測定各個(gè)處理下溶液中溶質(zhì)和蛋白質(zhì)含量。所有處理中固態(tài)酶制劑與提取液按2∶100(質(zhì)量體積比)溶解。

1.3測定指標(biāo)及方法

1.3.1酶制劑酶活性的測定

木聚糖酶的活性根據(jù)GB/T 23874—2009測定，其活性單位定義為：在37 ℃、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為5 mg/mL的木聚糖(山毛櫸材，Sigma X4252)溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。

β-葡聚糖酶活性根據(jù)NY/T 911—2004測定，其活性單位定義為：在37 ℃、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/mL的葡聚糖(大麥，Sigma G6513)溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活單位。

β-甘露聚糖酶采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(Q/HDTZW 0008—2012)測定，其活性單位定義為：在37 ℃、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為3 mg/mL的甘露聚糖(槐豆膠，Sigma G0753)溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活單位。

α-半乳糖苷酶采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(Q/HDTZW 0009—2012)測定，其活性單位定義為：在37 ℃、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的對硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷釋放1 μmol對硝基酚所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.3.2提取液中溶質(zhì)含量的測定

按0.02 g/mL濃度稱取0.8 g酶制劑溶解于40 mL溶解液中，在磁力攪拌器上(4 ℃低溫)溶解30 min，然后3 000 r/min離心3 min，取15 mL離心后的上清液，放入稱量瓶中，65 ℃烘干至無水痕后，再105 ℃烘干5 h稱重?？鄢鄳?yīng)溶解液空白溶質(zhì)含量，然后計(jì)算每毫升溶液中溶質(zhì)的含量(μg/mL)。

1.3.3提取液中蛋白質(zhì)含量的測定

提取液中蛋白質(zhì)的含量采用Thermo Scientific蛋白質(zhì)分析試劑盒(貨號：23225)測定。其原理為Cu2+在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原形成紫色復(fù)合物，在562 nm的吸光度與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系。將待測稀釋液25 μL，工作液200 μL加入微孔板密封，在振蕩器上震蕩30 s。然后在37 ℃孵育30 min后冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀在562 nm處測吸光值。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SAS 9.0的MEANS模塊對基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析。采用PROC GLM模塊對試驗(yàn)1進(jìn)行兩因素互作的方差分析，當(dāng)交互效應(yīng)顯著時(shí)，對12個(gè)處理進(jìn)行Duncan氏法多重比較。同樣，采用PROC GLM模塊對試驗(yàn)2進(jìn)行單因素方差分析。2個(gè)試驗(yàn)中處理間的差異檢驗(yàn)均采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1提取液及固-液分離方法對非淀粉多糖酶活性的影響

由表2可見，在4種提取液中，木聚糖酶經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后的測定活性最高(P<0.05)，而通過其他3種溶液提取后測定的活性稍低。β-葡聚糖酶經(jīng)去離子水提取后的測定活性最低(P<0.05)，而通過其他3種溶液提取后測定的活性稍高。β-甘露聚糖酶經(jīng)去離子水提取后的測定活性最高(P<0.05)，乙酸-乙酸鈉緩沖液提取后次之(P<0.05)，磷酸鹽緩沖液和0.9%NaCl溶液提取后的測定活性最低。酶制劑溶解后的固-液分離方法對木聚糖酶的測定活性無顯著性影響(P>0.05)。不分離顯著地降低了β-葡聚糖酶的測定活性(P<0.05)，而離心或過濾均顯著地降低了α-半乳糖苷酶的測定活性(P<0.05)。提取液的種類和酶制劑溶解后的固-液分離方法對4種非淀粉多糖酶的測定活性有極顯著的交互作用(P<0.01)。

在木聚糖酶中，去離子水提取后過濾分離的酶活性顯著地高于不分離或離心的相應(yīng)值(P<0.05)；乙酸-乙酸鈉緩沖液提取后固-液分離方法對酶活性的測定結(jié)果無顯著性影響(P>0.05)；磷酸鹽緩沖液提取后不分離的酶活性顯著地高于離心及過濾分離的相應(yīng)值(P<0.05)；0.9%NaCl溶液提取后離心或過濾分離的酶活性均顯著地高于不分離的相應(yīng)值(P<0.05)。在β-葡聚糖酶中，去離子水提取后固-液分離方法對酶活性的測定結(jié)果無顯著性影響(P>0.05)；乙酸-乙酸鈉緩沖液提取后，離心分離的酶活性顯著地低于不分離和過濾的相應(yīng)值(P<0.05)；而磷酸鹽緩沖液及0.9%NaCl溶液提取后，離心分離的酶活性均是較高的。在β-甘露聚糖酶中，去離子水提取后不分離或離心的酶活性均顯著地高于過濾的相應(yīng)值(P<0.05)；乙酸-乙酸鈉緩沖液提取后，離心分離的酶活性顯著地高于不分離和過濾的相應(yīng)值(P<0.05)；磷酸鹽緩沖液提取后固-液分離方法對酶活性的測定結(jié)果無顯著性影響(P>0.05)；0.9%NaCl溶液提取后過濾的酶活性較低(P<0.05)。在α-半乳糖苷酶中，去離子水、磷酸鹽緩沖液、0.9%NaCl溶液提取后離心的酶活性最低(P<0.05)，而乙酸-乙酸鈉緩沖液提取后過濾或離心的酶活性都是最低的(P<0.05)。

2.2提取液對非淀粉多糖酶溶解度的影響

由于試驗(yàn)1的結(jié)果表明離心對α-半乳糖苷酶活性有顯著地影響，因此，試驗(yàn)2不開展提取液對α-半乳糖苷酶溶解度影響的測試。提取液對3種固態(tài)酶制劑溶解離心后溶液中溶質(zhì)的含量列于表3。在木聚糖酶中，提取液中溶質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋阂宜?乙酸鈉緩沖液>去離子水>0.9%NaCl溶液>磷酸鹽緩沖液，除去離子水和0.9%NaCl溶液間差異不顯著(P>0.05)，其他任意2組間有顯著差異(P<0.05)。在β-葡聚糖酶中，提取液中溶質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋喝ルx子水=0.9%NaCl溶液>磷酸鹽緩沖液>乙酸-乙酸鈉緩沖液，除去離子水與0.9%NaCl溶液2處理間差異不顯著(P>0.05)外，其他任意2組間有顯著差異(P<0.05)。在β-甘露聚糖酶中，提取液中溶質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋?.9%NaCl溶液>去離子水>乙酸-乙酸鈉緩沖液>磷酸鹽緩沖液，除去離子水與0.9%NaCl溶液2處理間差異不顯著外(P>0.05)，其他提取液任意2處理間有顯著差異(P<0.05)。

表2　提取液及固-液分離方法對固態(tài)非淀粉多糖酶活性的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.3提取液對非淀粉多糖酶蛋白質(zhì)溶解度的影響

提取液對3種固態(tài)酶制劑溶解離心后溶液中蛋白質(zhì)的含量列于表4。在木聚糖酶中，提取液中蛋白質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋喝ルx子水>磷酸鹽緩沖液>0.9%NaCl溶液>乙酸-乙酸鈉緩沖液，除磷酸鹽緩沖液與0.9%NaCl溶液2處理間差異不顯著(P>0.05)外，其他任意2處理間有顯著差異(P<0.05)。在β-葡聚糖酶中，提取液中蛋白質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋喝ルx子水>0.9%NaCl溶液>磷酸鹽緩沖液>乙酸-乙酸鈉緩沖液，且任意2處理間有顯著差異(P<0.05)。在β-甘露聚糖酶中，提取液中蛋白質(zhì)含量的高低順序?yàn)椋喝ルx子水>0.9%NaCl溶液>磷酸鹽緩沖液>乙酸-乙酸鈉緩沖液，乙酸-乙酸鈉緩沖液與其他任意處理差異顯著(P<0.05)。

表3　提取液對非淀粉多糖酶溶解度的影響

表4　提取液對非淀粉多糖酶蛋白質(zhì)溶解度的影響

3　討　論

3.1提取液對固態(tài)酶制劑溶解性的影響

飼用酶制劑產(chǎn)品大部分是由微生物發(fā)酵后濃縮的酶蛋白吸附在小麥麩、小麥次粉、玉米芯粉及保護(hù)劑等載體上[7]，呈粉末狀。而某些耐高溫能力差的飼用酶，為了降低在制粒、膨化過程中酶活性的損失，以絕熱材料為載體，將酶制劑包裹在包被材料中[8]。不同生產(chǎn)廠家和不同活性規(guī)格的產(chǎn)品，載體的類型及在酶制劑中的含量有較大差異[9-10]。通過提取液溶解固態(tài)酶制劑后，溶解液中含有來自發(fā)酵濃縮物及載體中的可溶物。其中酶的溶解特性取決于酶蛋白的性質(zhì)及周圍環(huán)境的理化性質(zhì)，如pH、溫度、離子強(qiáng)度和介電常數(shù)等[11]。因此，不同來源的酶制劑在溶解特性上可能具有較大差異。高玲等[12]的研究表明，不同廠家生產(chǎn)的β-葡聚糖酶需要不同的提取液才能獲得最佳的酶抽提效果。然而，在飼用酶制劑活性的測定方法中，愛爾蘭Megazyme公司的測定試劑盒及國家標(biāo)準(zhǔn)方法都以測定酶活性所用的乙酸-乙酸鈉緩沖液抽提待測酶樣品[13-15]。本研究4種緩沖液中，乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解4種酶制劑后，總體上測定的酶活性較其他提取液高。在溶解后的離心上清液中，4種緩沖液對木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶制劑產(chǎn)品的溶解度呈現(xiàn)了較大的差異，且不同酶制劑達(dá)到最大溶解度的提取液并不相同。然而，乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解的上述3種酶制劑上清液中蛋白質(zhì)的含量卻最低。這表明乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解酶制劑后，非酶的雜蛋白質(zhì)含量相對較低。因此，相對于其他3種提取液，乙酸-乙酸鈉緩沖液可以最有效地將酶蛋白提取出來。

3.2固-液分離方法對固態(tài)酶制劑溶解液中酶活性的影響

非淀粉多糖酶的分子質(zhì)量大多為2×104～20×104u[8]，低離心力(如1 500×g)不會使溶解在溶液中的非淀粉多糖酶沉淀。因此，提取液對固態(tài)酶制劑溶解后多采用低速離心的方法分離溶解的酶液與未溶解物[5]。而愛爾蘭Megazyme公司的非淀粉多糖酶制劑活性測定試劑盒采用低速離心或過濾的方法獲得待測酶液。陸文清等[5]報(bào)道酶蛋白可能被過濾介質(zhì)吸附，且吸附量與分子量大小呈正相關(guān)，從而導(dǎo)致濾液測定的酶活性降低。本試驗(yàn)中，固-液不分離使β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的活性降低，這可能是仍有少量的酶蛋白仍吸附于載體上未釋放，因此，出現(xiàn)了測定酶活性稍低的現(xiàn)象。離心與過濾均使α-半乳糖苷酶的活性大幅降低，這可能是在酶溶液比在2∶100的條件下，α-半乳糖苷酶難以從載體中溶出，分離時(shí)大部分酶仍留在載體上，而對這一現(xiàn)象仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。過濾使β-甘露聚糖酶的活性降低，可能是由于濾紙對β-甘露聚糖具有一定的截留作用。因此，在本試驗(yàn)中α-半乳糖苷酶提取后不宜固液分離，而其他3種酶的提取液適宜進(jìn)行離心分離。

4　結(jié)　論

① 乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解可以最有效地將4種固態(tài)酶制劑的酶蛋白提取出來，發(fā)揮酶活性。

② α-半乳糖苷酶提取后不宜通過離心或過濾進(jìn)行固液分離，而其他3種酶的提取液在本試驗(yàn)條件下適宜進(jìn)行離心分離。

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(責(zé)任編輯田艷明)

Effects of Extraction Solution and Solid-Liquid Separation Method on the Activities of Non-Starch Polysaccharide Enzymes

LIAO Rui1,2ZHAO Feng1*QI Zhili2*ZHANG Hongfu1

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Animal Sciences and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

This experiment was conducted to investigate appropriate extract solution and solid-liquid separation method for evaluating enzyme in solid feed enzyme product. Extract solution of deionized water, acetic acid-sodium acetate buffer solution (0.1 mol/L, pH 5.50), phosphate buffer solution (0.05 mol/L, pH 6.00) or 0.9% NaCl solution and solid-liquid separation method of no separation, 3 000 r/min of centrifugation for 3 min or filtration were used in a 4×3 factorial arrangement. Each treatment contained 5 replicates with 2 determination in each. The activities of enzymes in the products were determined. Then, the effects of the types of extract solution on the contents of solute and protein were investigated for the enzyme products (excluding α-galactosidase) dissolved and centrifuged. The results showed that the highest determined activity of xylanase was presented in the phosphate buffer solution buffer solution (P<0.05). The similar determined activities of β-glucanase were observed in acetic acid-sodium acetate buffer solution, phosphate solution and 0.9% NaCl solution (P>0.05), and were significantly higher than that in deionized water (P<0.05). The greatest and greater determined activities of β-mannanase were observed in deionized water and acetic acid-sodium acetate buffer solution, respectively, and were significantly greater than those in phosphate solution or 0.9% NaCl solution (P<0.05). The type of extract solution had no significant effect on the determined activity of α-galactosidase (P>0.05). The solid-liquid separation method had no significant effect on the determined activity of xylanase (P>0.05). The greater determined activity of β-glucanase was observed in centrifugation or filtration (P<0.05). The greatest determined activity of β-mannanase was presented in centrifugation (P<0.05). However, the highest determined activity of α-galactosidase product was observed in no separation (P<0.05). There was a significant interaction between the type of extract solution and solid-liquid separation method in the determined activities of 4 enzyme products (P<0.01). The highest dry matter solubility of xylanase product was observed in acetic acid-sodium acetate buffer solution (P<0.05). The highest dry matter solubility of β-glucanase and β-mannanase was presented in deionized water and 0.9% NaCl solution (P<0.05). However, the lowest protein contents of xylanase, β-glucanase and β-mannanase were observed in acetic acid-sodium acetate buffer solution (P<0.05). It is concluded that acetic acid-sodium acetate buffer solution is the most efficient to extract the enzyme protein from the product. After dissolved, the α-galactosidase product is not suitable to separate, but the other enzymes can be separated with centrifugation.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3352-3358]

non-starch polysaccharide enzymes; extract solution; solid-liquid separation; enzyme activity

s: ZHAO Feng, associate professor, E-mail: zsummit@iascaas.net.cn; QI Zhili, associate professor, E-mail: zhiliqi@mail.hzau.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.040

2016-04-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172215)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

廖睿(1990—)，男，湖北鄂州人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: onemoremore@foxmail.com

趙峰，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zsummit@iascaas.net.cn；齊智利，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zhiliqi@mail.hzau.edu.cn

S816

A

1006-267X(2016)10-3352-07