不同纖維來源飼糧和細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群多樣性的影響

張永婧　劉　強　張文明　張志靜　王偉蘭　莊　蘇

(南京農業(yè)大學動物科技學院，南京210095)

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不同纖維來源飼糧和細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群多樣性的影響

張永婧劉強*張文明張志靜王偉蘭莊蘇

(南京農業(yè)大學動物科技學院，南京210095)

本試驗旨在利用末端限制性片段長度多態(tài)性技術研究不同纖維來源飼糧和細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群多樣性及其組成結構的影響。試驗選用8頭平均體重為(35.0±2.5) kg的“杜×長×大”三元雜交生長豬，統(tǒng)一安裝回腸末端T型瘺管，隨機分為4組，每組2個重復。試驗分4期，每期每組豬按4×4拉丁方設計飼喂小麥麩、小麥麩加酶、大豆皮和大豆皮加酶4種試驗飼糧之一。每期預試期15 d，正試期6 d。試驗結果表明：1)大豆皮飼糧組豬回腸食糜微生物的多樣性顯著高于小麥麩飼糧組(P<0.05)。2)小麥麩飼糧組顯著提高豬回腸食糜中普氏菌屬(Prevotella)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的豐度(P<0.05)，而大豆皮飼糧組則顯著提高豬回腸食糜中瘤胃球菌屬(Ruminococcus)及糞便中擬桿菌屬(Bacteroides)、毛螺菌屬(Lachnospira)的豐度(P<0.05)。3)添加細胞壁降解酶顯著提高各飼糧組豬回腸食糜中Lachnospira、真細菌屬(Eubacterium)及糞便中Lachnospira的豐度(P<0.05)，但也同時降低了回腸食糜中Lactobacillus、Prevotella及糞便中Lactobacillus、Bacteroides和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的豐度(P<0.05)。綜上所述，纖維飼糧可顯著提高豬腸道內非淀粉多糖降解菌的豐度，而細胞壁降解酶則可選擇性改變腸道微生物菌群的多樣性及其組成。

生長豬；飼糧纖維；細胞壁降解酶；腸道微生物；末端限制性片段長度多態(tài)性

豬腸道內寄居著種群龐雜的微生物[1]，腸道微生物除了發(fā)酵在小腸內未消化吸收的碳水化合物和蛋白質等養(yǎng)分，產生短鏈脂肪酸為豬提供能量之外，還通過維生素和酶合成、膽汁酸鹽重吸收、促進消化道發(fā)育及其免疫系統(tǒng)成熟等多種方式影響豬的營養(yǎng)與健康[2-3]。研究表明，飼糧對豬腸道微生物菌群結構有明顯影響，其中飼糧纖維的數量和類型備受關注[4]。谷物及其副產物中細胞壁非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)是豬飼糧的主要纖維來源，其含量、組成和化學結構因植物種類、組織和生長階段而異[5-6]?，F有同類研究多基于多種纖維來源的混合飼糧[2,4,7]，而對單一纖維來源飼糧的研究較少，不利于對飼糧NSP化學特性與豬消化道微生物菌群結構間構效關系的認識。

飼糧纖維通常不能被豬的內源消化酶降解，而且還會影響其他養(yǎng)分的消化利用，被視為一類抗營養(yǎng)因子[8]。養(yǎng)豬和飼料生產實踐中，消除飼糧纖維副作用最常見的對策是添加NSP降解酶等外源酶制劑[9-10]。Bedford等[11]研究表明，外源NSP降解酶可促進不溶性NSP降解，生成可發(fā)酵寡糖，進而影響腸道微生物組成。然而，產生的寡糖結構又隨飼糧NSP組成和外加NSP降解酶種類而異。同時，腸道微生物對寡糖的利用能力也存在著明顯的種屬差異性[12-14]。因此，本試驗旨在利用末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技術研究纖維來源(小麥麩或大豆皮)以及添加外源細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群多樣性的影響，為深入了解飼糧纖維組成與豬腸道微生物菌群結構間的構效關系，以及細胞壁降解酶在谷物副產物飼用開發(fā)中的應用潛力提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗設計

試驗選用8頭平均體重為(35.0±2.5) kg的“杜×長×大”三元雜交生長豬，統(tǒng)一安裝回腸末端T型瘺管(回盲瓣前15～20 cm)，隨機分為4組，每組2個重復。試驗分4期，每期每組試驗豬按4×4拉丁方設計安排飼喂1種試驗飼糧，每個試驗期21 d，其中前15 d為預試期，飼喂全價配合飼糧(購自江蘇海普瑞飼料有限公司)，預試期第1天試驗飼糧替換部分全價配合飼糧，5 d內全部替換為試驗飼糧，其余10 d用于豬適應試驗飼糧并維持腸道菌群的穩(wěn)定。第16～18天肛門采集糞便樣品，第19～21天11:00和14:00采集回腸食糜樣品。樣品用無菌袋收集，封裝在經高溫滅菌的5 mL塑料離心管內，-80 ℃凍存。T-RFLP分析前，將樣品室溫消融，分別等量混合每個試驗期3 d采集的飼喂同一種飼糧的2頭豬的回腸食糜和糞便樣品，作為分析試樣。

1.2飼糧組成及營養(yǎng)水平

試驗飼糧參照我國《瘦肉型豬飼養(yǎng)標準》(2004年版)配制，分別以小麥麩和大豆皮[均購自東海糧油(張家港)有限公司]作為單一纖維源，輔以玉米淀粉、魚粉、血粉和指示劑三氧化二鉻(Cr2O3)等配成2種營養(yǎng)均衡，能量、蛋白質、纖維水平相近的半純合基礎飼糧，分別為小麥麩飼糧(wheat bran diet，WB)和大豆皮飼糧(soybean hull diet，SH)，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在2種基礎飼糧中分別添加相同劑量的混合酶制劑(纖維素酶1 000 U/kg、木聚糖酶5 000 U/kg和植酸酶1 500 U/kg)，共形成4種試驗飼糧。

1.3檢測指標

1.3.1DNA提取

參考Bindelle等[15]的方法提取腸道微生物總DNA。

表1　基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)維生素預混料為每千克飼糧提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 10 000 IU，VD34 000 IU，VE 32 mg，VK34 mg，VB13 mg，VB28 mg，VB65 mg，VB120.05 mg，煙酸 nicotinic acid 45 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 20 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 0.15 mg，氯化膽堿 choline chloride 360 mg。

2)微量元素預混料為每千克飼糧提供 The mineral premix provided the following per kg of diets：Fe 150 mg，Cu 8 mg，Zn 100 mg，Mn 50 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。

3)消化能為計算值，其余為實測值。DE was a calculated value and the others were measured values.

1.3.2PCR擴增

試驗選用16S rRNA全序列引物：8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR(ABI VeritiTM96-well Thermal Cycler，美國ABI公司)反應體系共25 μL，含2種引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶12.5 μL，無菌水10.5 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。取5.0 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(EPS604電泳儀，南京科室儀器研究所研制)檢測，預期擴增產物大小約1 500 bp。

1.3.3限制性內切酶酶切

利用AxyPrep PCR產物純化試劑盒(美國Axygen公司)對PCR產物進行純化，而后各取5 μL純化產物，采用限制性內切酶HhaI(日本Takara公司1056A)進行酶切。酶切體系為20 μL：PCR純化產物5 μL，10 mol/L Buffer 2 μL，內切酶 1 μL，滅菌水12 μL。37 ℃酶切2 h，65 ℃滅活30 min。

1.3.4酶切產物毛細管電泳

純化后的酶切產物在DNA測序儀(美國ABI公司ABI 3730XL DNA Analyzer)上進行毛細管電泳(樣品送上海生工生物工程技術服務有限公司檢測)。

1.4數據處理與分析

電泳條帶利用GeneMarker V2.2.0軟件進行定性和定量分析，獲得樣品各個末端限制性片段(terminal restriction fragments,T-RFs)的長度、峰高及峰面積等參數。剔除長度小于50 bp和大于600 bp的片段，并根據片段峰高計算微生物菌群的多樣性指數。利用MICA: T-RFLP Analysis[16]軟件在線分析片段所對應的微生物種屬。采用SPSS 18.0中GLM模型法對多樣性指數和各片段相對含量進行2因素完全因子ANOVA分析，比較不同纖維飼糧組間微生物組成的差異。P<0.05時表示差異顯著，P<0.10時表示有差異趨勢。

微生物菌群多樣性指數計算公式及其定義如下：

物種豐度(表示微生物菌群中

物種的個數)=限制性片段的個數；

香儂威納指數(表示微生物菌群組成的復雜程度，

該指數越大，表明菌群的組成結構越復雜)=

-∑PilnPi；

辛普森指數(表示菌群中優(yōu)勢菌屬

所占比重及菌群的均衡度，該指數越大，

表明優(yōu)勢菌屬所占的比例越大，菌群均衡度則

式中：Pi表示第i個峰的峰高占總峰高的比例。

2　結果與分析

2.1微生物菌群多樣性

經軟件分析，本試驗平均每頭豬回腸末端食糜和糞便樣品中獲得長度在50～600 bp的酶切片段分別為21和35個，其中相對含量在1%以上的片段分別為13和17個。各飼糧組豬回腸末端食糜和糞便中微生物菌群的多樣性指數見表2。SH組豬回腸末端的微生物豐度顯著高于WB組(P<0.05)，但纖維來源對豬糞便微生物的物種豐度及香儂威納指數均無顯著影響(P>0.05)。添加酶制劑有提高SH組豬回腸食糜微生物菌群香儂威納指數的趨勢(P<0.10)。各飼糧組豬回腸食糜微生物菌群的辛普森指數受纖維來源與酶制劑之間交互作用的影響(P<0.05)。

2.2豬回腸末端食糜微生物的豐度

試驗獲得相對含量大于1%的回腸末端食糜微生物T-RFs共13個，其所代表菌屬及相對含量見表3。WB組顯著提高豬回腸末端食糜微生物菌群中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和普氏菌屬(Prevotella)的豐度(P<0.05)，而SH組則顯著提高豬回腸中瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的豐度(P<0.05)。添加酶制劑顯著提高各飼糧組豬回腸中變形菌門(Proteobacteria)的未知菌、毛螺菌屬(Lachnospira)和真細菌屬(Eubacterium)的豐度(P<0.05)，但顯著降低WB組豬回腸中Lactobacillus和Prevotella的豐度(P<0.05)。各飼糧組豬回腸食糜微生物菌群中Lactobacillus和Prevotella的豐度受纖維來源與酶制劑之間交互作用的影響(P<0.05)。

表2　各飼糧組豬回腸末端食糜和糞便樣品中微生物菌群的多樣性指數

表3　各飼糧組豬回腸末端食糜微生物的豐度

T-RFs：末端限制性片段；ND：未檢測出；F：厚壁菌門；P：變形菌門；B：擬桿菌門。下表同。

T-RFs: terminal restriction fragments; ND: not detected; F: Firmicutes; P: Proteobacteria; B: Bacteroidetes. The same as below.

2.3豬糞便微生物的豐度

試驗獲得相對含量大于1%的糞便微生物T-RFs共17個，其所代表菌屬及相對含量見表4。WB組顯著提高豬糞便微生物菌群中巨單胞菌屬(Megamonas)和光崗菌屬(Mitsuokella)的豐度(P<0.05)，Lactobacillus和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的豐度相比于SH組有升高趨勢(P<0.10)。SH組則顯著提高豬糞便中擬桿菌屬(Bacteroides)和Lachnospira的豐度(P<0.05)。添加酶制劑顯著提高各飼糧組豬糞便中Proteobacteria內未知菌和Lachnospira的豐度(P<0.05)，同時顯著降低Lactobacillus和Klebsiella的豐度(P<0.05)，以及SH組豬糞便中Bacteroides的豐度(P<0.05)。各飼糧組豬糞便微生物菌群中Eubacterium的豐度受纖維來源與酶制劑之間交互作用的影響(P<0.05)。

表4　各飼糧組豬糞便微生物的豐度

3　討　論

3.1不同纖維來源飼糧和細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群多樣性的影響

總體而言，本試驗豬糞便樣品微生物的物種豐度明顯高于回腸末端食糜樣品，物種豐度越高表明該菌群的多樣性越高，其組成結構越復雜，相應地該菌群中優(yōu)勢菌屬的比重則越低。飼糧纖維來源和酶制劑對豬回腸食糜微生物多樣性有不同程度的影響，但對糞便微生物的多樣性相關指數均無顯著影響。該結果表明豬小腸微生物區(qū)系更易受飼糧因素的影響，而大腸微生物區(qū)系因其組成結構復雜且均衡度高則相對穩(wěn)定。一般來講，消化道微生物的生長發(fā)育與飼糧中可利用底物的種類和數量有一定關系[17]。本試驗2種纖維飼糧的中性洗滌纖維含量雖然接近，但WB的NSP主要由阿拉伯糖、木糖和葡萄糖(阿拉伯木聚糖和纖維素)組成，而SH除此之外還含有較高的糖醛酸(果膠類物質)，總NSP含量也高于WB。此外，大豆皮中可溶性NSP的含量也顯著高于小麥麩[2,6]。雖然Liu等[4]表明高果膠飼糧和高阿拉伯木聚糖飼糧并未對豬腸道微生物多樣性產生顯著影響，但Ivarsson[1]卻發(fā)現小麥麩飼糧會刺激豬回腸微生物菌群中Lactobacillus的生長，且推測該菌能產生抗菌化合物，抑制其他菌種繁衍，從而導致豬腸道微生物多樣性的下降。本試驗WB組豬回腸末端食糜微生物菌群的豐度顯著低于SH組，也可能與WB可利用底物的多樣性及阿拉伯木聚糖選擇性刺激Lactobacillus的生長有關。

3.2不同纖維來源飼糧和細胞壁降解酶對豬腸道微生物菌群組成結構的影響

Lamendella等[18]指出，豬腸道內的微生物多與碳水化合物代謝有關，其中主要為革蘭氏陽性菌厚壁菌門(Firmicutes)和革蘭氏陰性菌擬桿菌門(Bacteroidetes)。本試驗鑒定為梭菌屬(Clostridium)、Lactobacillus、腸球菌屬(Enterococcus)、Eubacterium、Megamonas、Mitsuokella、Lachnospira和Ruminococcus等菌屬的T-RFs均屬于Firmicutes，總平均豐度分別占回腸食糜和糞便微生物總量的72%和65%，該結果與Lamendella等[18]和Niu等[19]在豬腸道內的研究結果相似。研究表明，大多數Firmicutes細菌能分泌胞外多糖降解酶，部分菌屬(如Ruminococcus和Clostridium)具有結構復雜的多功能纖維小體，既能降解不溶性的木葡聚糖和木聚糖等半纖維素，也能有效降解纖維素，釋放可溶性寡糖，但個別菌種[如熱纖梭菌(R.thermocellum)]并不能利用其戊聚糖降解產物[20-21]。而Bacteroidetes細菌(如Prevotella)的糖降解代謝系統(tǒng)復雜且全面，易受底物調控，適應能力極強，主要參與降解寡糖、淀粉、果膠、木葡聚糖和木聚糖等多種可溶性多糖，但對纖維素降解能力較差[22]。本試驗所得豬腸道細菌絕大多數來自Firmicutes，而Bacteroidetes細菌豐度相對較低(1.53%～19.28%)，可能與WB和SH中NSP均以不溶性多糖為主(分別占總NSP的84%和77%)有關。然而從小腸到大腸，Bacteroidetes細菌的豐度明顯升高，這可能是由于在細菌和外源多糖酶制劑的作用下，飼糧NSP的溶解量增加或生成可溶性寡糖[23]，為Bacteroidetes細菌提供適宜的可利用底物。本試驗所有組豬回腸末端食糜中檢測出的Proteobacteria細菌豐度都明顯高于同類研究。例如，在前人的研究中Klebsiella與腸道木聚糖的降解有關，但相對豐度較低[24]。Proteobacteria細菌多數與蛋白質發(fā)酵有關[25]，該菌門豐度升高的原因可能與本試驗為平衡各纖維飼糧的蛋白質與能量比，添加了較高含量的魚粉和血漿蛋白粉等動物蛋白質原料有關。隨著絕大多數飼糧蛋白質在小腸中被消化[26]，該門細菌的豐度從回腸食糜到糞便顯著下降，這也間接證明了上述推測。同理，隨著飼糧淀粉在回腸之前幾乎被完全消化[26]，各試驗組豬糞便中Lactobacillus和Enterococcus(腸道內主要淀粉降解菌[2,27])的豐度也較回腸食糜明顯下降，糞便中甚至均未檢測出Enterococcus?？梢?，可利用養(yǎng)分對腸道菌群組成可能起著決定性作用。

腸道微生物對NSP的降解程度既取決于其自身的理化特性(如單糖組成、聚合度和溶解性等)[28]，也與腸道微生物菌屬間的互作有關[1]。研究表明，Clostridium菌屬是人類腸道中主要的纖維降解菌，與Eubacterium和Prevotella等菌屬互作可有效降解纖維素及半纖維素[29-31]。本試驗各飼糧組豬腸道中均以Clostridium相對豐度最高，且不受纖維來源和外源酶制劑的影響。Lactobacillus和Bacteroides的豐度次之，但前者在WB組豬回腸食糜和糞便中的豐度均顯著高于SH組，而后者僅在糞便中出現，且SH組中的豐度高于WB組。Sanchez等[32]研究表明，某些Lactobacillus菌種能分泌阿拉伯木聚糖水解酶，在木寡糖或阿拉伯木聚糖培養(yǎng)基內生長。Ivarsson[1]也報道，麥麩可促進豬腸道內Lactobacillus的生長，與本試驗的結果基本吻合。同為Bacteroidetes的Prevotella和Bacteroides，前者僅出現在回腸食糜中，而后者僅出現在糞便中，可能與Bacteroides主要利用可溶性多糖和寡糖有關[28]。同為乳酸利用菌的Megamonas和Mitsuokella，前者在回腸食糜中的豐度相當高，而在糞便中顯著下降；而Mitsuokella僅在糞便中出現，同時伴隨著一種未知丁酸生成菌(產丁酸菌)的出現，可能是腸道微生物之間在底物降解和產物利用方面存在互作關系的體現。據Weber等[33]報道，Lachnospira為人類腸道的主要果膠降解菌。該屬細菌在本試驗SH組豬糞便中的豐度顯著高于WB組，與SH的果膠含量高于WB相對應。未添加外源酶制劑時，表3中各飼糧組豬回腸食糜中均未檢測出Lachnospira，而添加酶制劑后其豐度均顯著升高，說明添加細胞壁降解酶促進原料中果膠的溶解或降解。但是無論WB或SH，其中的果膠成分主要在豬后腸發(fā)酵[34-35]，因此糞便中該菌屬的豐度顯著高于回腸食糜。類似地，由于外源細胞壁降解酶加快淀粉在豬回腸之前的消化[11]，減少了淀粉降解菌Lactobacillus的可利用底物，使其豐度下降，表現出Bedford等[11]所謂的外源酶制劑對小腸內淀粉降解菌生長的抑制現象。

盡管T-RFLP技術具有快速、低成本和高通量的優(yōu)點，但僅依據限制性酶切片段長度而非其堿基序列信息不足以準確區(qū)分微生物的種類。根據其原理可知，該方法所得結果可能受內切酶的種類和作用時間、毛細管電泳圖譜質量以及數據庫范圍等因素的影響，導致菌屬間的歸屬出現誤差。例如，片段T-RF 370在Jensen等[36]的研究中被歸屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，而與之僅有1個堿基長度差的T-RF 371在本試驗中則被歸屬于Klebsiella。為了驗證T-RFLP結果的可靠性，本次試驗進一步對樣品進行了Illumina MiSeq高通量測序。初步統(tǒng)計結果表明，雖然高通量測序技術可鑒定出更多的微生物種類，且能鑒定到屬水平，但二者所得微生物菌群的多樣性和與纖維相關的優(yōu)勢菌屬基本一致。本文基于T-RFLP技術所得結果，在反映腸道微生物菌群多樣性方面也具有一定的參考價值。

4　結　論

① T-RFLP檢測結果表明，纖維來源顯著影響豬回腸末端食糜微生物菌群的多樣性，但對糞便微生物的多樣性無顯著影響。

② 小麥麩飼糧可顯著提高豬腸道微生物菌群中半纖維素降解菌Lactobacillus、Prevotella、Megamonas和Mitsuokella等的豐度，而大豆皮飼糧則顯著提高豬腸道中果膠降解菌Lachnospira、纖維素降解菌Ruminococcus和Bacteroides等的豐度。

③ 添加酶制劑選擇性地影響豬腸道微生物菌群中Lachnospira、Eubacterium、Lactobacillus、Prevotella和Bacteroides等的豐度。

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(責任編輯武海龍)

Gastrointestinal Microbial Flora Diversity in Pigs Fed Different Fibrous Diets with or without Cell Wall-Degrading Enzyme Supplementation

ZHANG YongjingLIU Qiang*ZHANG WenmingZHANG ZhijingWANG WeilanZHUANG Su

(College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The microbial flora diversity and composition in pigs fed different fibrous diets with or without cell wall-degrading enzyme supplementation were compared using terminal restriction fragment length polymorphism analysis technique. Eight growing castrated pigs fitted with a T-shaped cannula at the terminal ileum were randomly assigned to four diets, i.e., wheat bran-based diet (WB), enzyme-supplemented WB, soybean hull-based diet (SH), and enzyme-supplemented SH, according to a 4×4 Latin square design. The experiment lasted for 6 days after 15 days of adaptation in each period. The results showed as follows: 1) the microbial diversity of ileal digesta of pigs fed SH was significantly higher than that of pigs fed WB (P<0.05). 2) The WB diet increased the abundances ofPrevotellaandLactobacillusin ileal digesta (P<0.05), whereas the SH diet increased the abundances ofRuminococcusin ileal digesta and Bacteroides andLachnospirain feces (P<0.05). 3) Adding cell wall-degrading enzyme significantly increased the abundances ofLachnospiraandEubacteriumin ileal digesta andLachnospirain feces (P<0.05), whereas decreased the abundances ofLactobacillus,Prevotellain ileal digesta andLactobacillus,BacteroidesandKlebsiellain feces (P<0.05). In conclusion, dietary fiber significantly increases the abundances of fiber-degrading bacteria, and cell wall-degrading enzyme supplementation selectively alters the microbial diversity and composition.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3275-3283]

growing pigs; dietary fiber; cell wall-degrading enzyme; gastrointestinal microbiota; terminal restriction fragment length polymorphism

, associate professor, E-mail： liuayang@njau.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.031

2016-04-02

國家自然科學基金項目(31172237)

張永婧(1990—)，女，天津人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail： 1085285725@qq.com

劉強，副教授，碩士生導師，E-mail： liuayang@njau.edu.cn

S816.35

A

1006-267X(2016)10-3275-09