地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)奶牛粗飼料瘤胃降解參數(shù)和微生物區(qū)系的影響

李　洋　張幸怡　張廣寧　王一臻　林　聰　徐宏建　姜　鑫　劉　帥　張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

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地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)奶牛粗飼料瘤胃降解參數(shù)和微生物區(qū)系的影響

李洋張幸怡張廣寧王一臻林聰徐宏建姜鑫劉帥張永根*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

本試驗(yàn)旨在研究地頂孢霉培養(yǎng)物(ATC)對(duì)奶牛粗飼料瘤胃降解參數(shù)和微生物區(qū)系的影響。試驗(yàn)選用體重650 kg左右、裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛3頭，采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加15(低劑量組)和30 g/(d·頭)ATC的試驗(yàn)飼糧(高劑量組)；試驗(yàn)共3期，每期27 d，其中預(yù)試期15 d，正試期12 d。測(cè)定羊草、玉米青貯、苜蓿的瘤胃降解參數(shù)和瘤胃微生物區(qū)系的變化。結(jié)果表明：1)與對(duì)照組相比，高劑量組能夠顯著提高玉米青貯干物質(zhì)的有效降解率和慢速降解部分的降解速率(P<0.05)；高劑量組羊草、玉米青貯、苜蓿中性洗滌纖維的有效降解率均顯著高于其他2組(P<0.05)，羊草中性洗滌纖維的慢速降解部分的降解速率和苜蓿中性洗滌纖維的可降解部分含量均顯著高于其他2組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，高劑量組顯著提高了玉米青貯粗蛋白質(zhì)的有效降解率和快速降解部分含量(P<0.05)，試驗(yàn)組顯著提高了苜蓿粗蛋白質(zhì)的有效降解率(P<0.05)，高劑量組顯著提高了羊草粗蛋白質(zhì)的慢速降解部分和可降解部分含量(P<0.05)，但并沒有提高有效降解率(P>0.05)。2)與對(duì)照組相比，高劑量組顯著提高了瘤胃中原蟲數(shù)量及黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和普雷沃氏菌的相對(duì)含量(P<0.05)，試驗(yàn)組顯著提高了反芻獸新月單胞菌的相對(duì)含量(P<0.05)，但高劑量組顯著降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)含量(P<0.05)。因此，本試驗(yàn)條件下，ATC能夠調(diào)節(jié)奶牛部分瘤胃微生物的菌群數(shù)量并提高粗飼料的瘤胃降解率，其中以30 g/(d·頭)添加量為宜。

地頂孢霉培養(yǎng)物；奶牛；粗飼料；瘤胃降解率；微生物區(qū)系

粗飼料是反芻動(dòng)物的重要飼料來(lái)源，其最主要的營(yíng)養(yǎng)作用是滿足反芻動(dòng)物對(duì)纖維素的需求[1]。瘤胃微生物通過(guò)對(duì)粗飼料的充分利用來(lái)維持自身能量需要，同時(shí)，粗飼料經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，為動(dòng)物機(jī)體供能。此外，粗飼料對(duì)維持動(dòng)物健康，促進(jìn)反芻動(dòng)物消化吸收功能，維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等都具有重要作用[2]。因此，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)或非營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等措施提高粗飼料的利用效率，對(duì)改善植物資源利用現(xiàn)狀，提高奶牛生產(chǎn)性能，乃至緩解我國(guó)優(yōu)質(zhì)粗飼料短缺的基本國(guó)情都具有非常重要的意義。

粗飼料中纖維類物質(zhì)含量較高且消化率低，導(dǎo)致了反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料的充分利用受到了限制。而通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或外源添加劑來(lái)調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料的利用，提高粗飼料的利用率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值被認(rèn)為是一種行之有效的方法[2-4]。古尼蟲草是我國(guó)稀有的中藥材，其藥理成分與冬蟲夏草生藥相似，具有免疫調(diào)節(jié)，抗炎鎮(zhèn)痛等功效[5-6]。古尼蟲草中功能性成分(蟲草酸、蟲草素和蟲草多糖等)使其具有優(yōu)秀的藥理作用，但昂貴的價(jià)格限制了其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用和發(fā)展。地頂孢霉培養(yǎng)物(Acremoniumterricolaculture，ATC)是由從古尼蟲草分離的地頂孢霉菌經(jīng)人工發(fā)酵而得到的產(chǎn)品，擁有蟲草素、蟲草酸、多糖、甾醇和氨基酸等功能性成分，可被用于天然古尼蟲草的替代物質(zhì)。據(jù)證明，添加地頂孢霉培養(yǎng)物能夠提高仔豬增重[7]，提高蛋鴨的體重和產(chǎn)蛋率，改善蛋品質(zhì)[8]。國(guó)外也有報(bào)道與地頂孢霉培養(yǎng)物具有相同功能性成分的蛹蟲草菌絲能夠增加瘤胃體外產(chǎn)氣量和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，提高濾紙纖維素的降解率[9]，調(diào)節(jié)部分瘤胃纖維降解菌數(shù)量[10]，提高纖維酶活性[11]，從而改善瘤胃內(nèi)環(huán)境和發(fā)酵狀態(tài)。以上研究證明，由于功能性成分的相同或類似，地頂孢霉培養(yǎng)物具有調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系的潛力和提高粗飼料的降解率的可能性。但目前，地頂孢霉培養(yǎng)物的添加對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵是否有積極作用，尤其對(duì)奶牛粗飼料降解以及體內(nèi)微生物區(qū)系的影響效果未見試驗(yàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在裝有瘺管的奶牛飼糧中添加地頂孢霉培養(yǎng)物探索其對(duì)奶牛常用粗飼料的瘤胃降解參數(shù)和微生物區(qū)系的影響作用，為開發(fā)地頂孢霉培養(yǎng)物為奶牛瘤胃發(fā)酵有效調(diào)控劑提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

地頂孢霉培養(yǎng)物購(gòu)自合肥邁可羅生物工程有限公司。地頂孢霉培養(yǎng)物是由古尼蟲草中提取的地頂孢霉菌經(jīng)沙氏葡萄糖瓊脂(SDAY)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)、察氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和發(fā)酵罐人工發(fā)酵等3級(jí)發(fā)酵法得到的滅活的蟲草類真菌飼料添加劑，含有26.84%粗蛋白質(zhì)(CP)、5.00%粗纖維(CF)、3.06%粗脂肪(EE)、4.04%粗灰分(ash)和61.06%無(wú)氮浸出物(NFE)[干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)]。其中功能性成分含量分別是：蟲草酸84.50 g/kg、蟲草多糖44.60 g/kg、蟲草素0.432 g/kg、甾醇0.597 g/kg、總氨基酸218.1 g/kg。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用3頭體重600 kg左右，裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛。奶牛自由飲水，每天07:00和19:00飼喂基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)處理包括：對(duì)照組，基礎(chǔ)飼糧組(不含添加劑)；低劑量組，基礎(chǔ)飼糧+15 g/(d·頭)ATC；高劑量組，基礎(chǔ)飼糧+30 g/(d·頭)ATC。試驗(yàn)共3期，每期27 d，其中預(yù)試期15 d，正試期12 d。在預(yù)試期晨飼前，將ATC與100 g左右的基礎(chǔ)飼糧進(jìn)行混合，預(yù)先飼喂給奶牛，待奶牛完全采食后，繼續(xù)飼喂其他基礎(chǔ)飼糧，以保證奶牛對(duì)ATC的完全采食[12]。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：Mn 3 500 mg，F(xiàn)e 1 600 mg，Zn 10 000 mg，Cu 1 500 mg，I 120 mg，Se 80 mg，Co 50 mg，VA 800 000 IU，VD 700 000 IU,VE 10 000 IU。

2)泌乳凈能為計(jì)算值[13]，其余均為實(shí)測(cè)值。NELwas a calculated value[13], while the others were measured values.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1營(yíng)養(yǎng)水平的測(cè)定

根據(jù)AOAC(2000)[14]的方法進(jìn)行干物質(zhì)(AOAC，930.15)、粗蛋白質(zhì)(AOAC，976.05)、粗灰分(AOAC，942.05)、鈣和磷含量(AOAC，935.13)的測(cè)定。粗纖維和粗脂肪含量的測(cè)定根據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[15]。中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量根據(jù)Van Soest的方法，采用纖維分析儀(Ankom200，美國(guó)安康公司)進(jìn)行測(cè)定[16]。蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和甾醇含量采用高效液相色譜法(高效液相色譜儀型號(hào)model-8800，日本HITACHI公司)進(jìn)行測(cè)定[17]。氨基酸含量采用全自動(dòng)氨基酸分析儀(model-8900，日本HITACHI公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2瘤胃降解率的測(cè)定

于正試期，采用體內(nèi)尼龍袋法測(cè)定各組對(duì)奶牛對(duì)3種粗飼料(羊草、玉米青貯、苜蓿)的瘤胃降解率[18]，3期各組按相同順序投放待測(cè)粗飼料，確保每期每組都測(cè)定3種粗飼料。選擇300目尼龍布制成10 cm×20 cm的尼龍袋，準(zhǔn)確稱取7 g粗飼料樣品于尼龍袋內(nèi)，樣本容量與表面積比為17.5 mg/cm2。粗飼料的培養(yǎng)時(shí)間分別是0、4、8、12、24、36、48、72 h，每個(gè)樣本的各時(shí)間點(diǎn)尼龍袋的數(shù)目依次是2、2、3、4、4、4、6、6和6個(gè)(隨著時(shí)間點(diǎn)的推移，消失率的提高，增加尼龍袋數(shù)目，以滿足后續(xù)樣本量的要求)，。培養(yǎng)后，將尼龍袋從瘤胃內(nèi)取出，同0 h尼龍袋一起置于冷水下沖洗終止發(fā)酵并洗凈瘤胃內(nèi)容物，洗至水清為止。洗凈后，所有尼龍袋在65 ℃下干燥48 h。干燥的樣品粉碎過(guò)1 mm篩，4 ℃保存待測(cè)。

參照?rskov等[19]提出的瘤胃動(dòng)力學(xué)計(jì)算模型計(jì)算粗飼料的瘤胃降解率，公式如下：

Y=a+b(1-e-ct)。

式中：Y為尼龍袋在瘤胃中滯留t(h)時(shí)間后的飼料某一營(yíng)養(yǎng)成分的降解率(%)；a為快速降解部分(%)；b為慢速降解部分(%)；c為慢速降解部分的降解速率(%/h)。下式同。

有效降解率的計(jì)算公式如下：

ED=a+[b×c/(c+k)]。

式中：ED為有效降解率(%)；k為待測(cè)飼料的瘤胃外流速度常數(shù)(%/h)，本試驗(yàn)中粗飼料的k值被假設(shè)為0.04%/h[13]。

1.3.3瘤胃原蟲計(jì)數(shù)

在正試期最后2 d，于晨飼后0、2、4、6、8和10 h從瘤胃不同位點(diǎn)采集瘤胃內(nèi)容物，立即用4層紗布過(guò)濾，收集瘤胃液用于瘤胃原蟲計(jì)數(shù)[1]。瘤胃原蟲數(shù)量的測(cè)定采用的是Ogimoto等[20]描述的方法。取0.5 mL瘤胃液加入2 mL甲基綠-甲醛-鹽溶液(35%的福爾馬林100 mL，氯化鈉8.0 g，甲基綠0.6 g，溶于900 mL蒸餾水中)輕輕振蕩，混勻?；旌虾箪o止5 min，滴入0.3 mm的血球計(jì)數(shù)板中，通過(guò)顯微鏡確定原蟲數(shù)量，同一個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。原蟲數(shù)量計(jì)算公式如下：

原蟲數(shù)量(個(gè)/mL)=(A/5)×B×104×C。

式中：A為計(jì)數(shù)板5個(gè)計(jì)數(shù)方格中的原蟲數(shù)量；B為計(jì)數(shù)方格數(shù)；C為稀釋倍數(shù)。

1.3.4瘤胃菌群相對(duì)含量的測(cè)定

在正試期最后2 d，于晨飼后0、2、4、6、8和10 h于瘤胃內(nèi)多點(diǎn)收集瘤胃內(nèi)容物，4層紗布過(guò)濾后收集瘤胃液[21-22]，用于瘤胃細(xì)菌數(shù)量的檢測(cè)。瘤胃液中的總DNA提取采用的是珠磨-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[23]。風(fēng)干后的總DNA溶于TE緩沖液后，于-20 ℃待測(cè)。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定所提取的總DNA的濃度和純度，確保OD260 nm與OD280 nm比值在1.6～1.8之間。通過(guò)熒光定量PCR的方法對(duì)瘤胃液中的總菌、普雷沃氏菌(Prevotella)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和反芻獸新月單胞菌(Selenomonasruminantium)的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，引物參考Khafipour等[24]報(bào)道的序列，序列見表2。熒光定量PCR所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，Real-time PCR SYBR Green Ⅰ RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性7 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

根據(jù)測(cè)得的閾值循環(huán)(Ct)，計(jì)算目標(biāo)菌的相對(duì)含量，公式如下：

目標(biāo)菌相對(duì)含量(%)=2-(Ct目標(biāo)菌-Ct總菌)×100[25]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

按照3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.2軟件包中的PROC MIXED程序進(jìn)行分析。模型如下：

Yijk=μ+Ti+Pj+Ck+Eijk。

式中：Yijk為因變量值；μ為總體平均值；Ti為處理(i=1，2，3)；Pj為試驗(yàn)期(j=1，2，3)；Ck為試驗(yàn)牛(k=1，2，3)；Eijk為殘差。P<0.05為差異顯著，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)的形式表示。

表2　熒光定量PCR引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同粗飼料干物質(zhì)瘤胃降解參數(shù)的影響

由表3可知，ATC提高了玉米青貯干物質(zhì)的慢速降解部分的降解速率和有效降解率。與對(duì)照組相比，高劑量組的慢速降解部分的降解速率顯著升高(P<0.05)；對(duì)照組和低劑量組的有效降解率間比較差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于高劑量組(P<0.05)。ATC對(duì)羊草和苜蓿的干物質(zhì)瘤胃降解參數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。

2.2地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同粗飼料NDF瘤胃降解參數(shù)的影響

由表4可知，ATC提高了羊草、玉米青貯和苜蓿NDF的有效降解率。高劑量組NDF的有效降解率顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)，而對(duì)照組和低劑量組間差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高劑量組顯著提高了羊草的慢速降解部分降解速率和苜蓿的可降解部分含量(P<0.05)。ATC對(duì)3種粗飼料的其他瘤胃降解參數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。

2.3地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同粗飼料粗蛋白質(zhì)瘤胃降解參數(shù)的影響

由表5可知，ATC提高了玉米青貯和苜蓿粗蛋白質(zhì)的有效降解率、玉米青貯粗蛋白質(zhì)的快速降解部分含量、苜蓿粗蛋白質(zhì)的慢速降解部分的降解速率。高劑量組玉米青貯的粗蛋白質(zhì)有效降解率顯著高于另外2組(P<0.05)，但另外2組間差異不顯著(P>0.05)。苜蓿的粗蛋白質(zhì)有效降解率，3組間差異均顯著(P<0.05)，對(duì)照組最低，高劑量組最高。與對(duì)照組相比，高劑量組的羊草粗蛋白質(zhì)的慢速降解部分和可降解部分含量均顯著高于其他組(P<0.05)，低劑量組的慢速降解部分含量最低，且顯著低于其他組(P<0.05)。高劑量組玉米青貯粗蛋白質(zhì)的快速降解部分含量顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)，且這2組間差異不顯著(P>0.05)。低劑量組苜蓿粗蛋白質(zhì)的慢速降解部分的降解速率顯著高于其他2組(P<0.05)，且其他2組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響

由表6可知，ATC提高了瘤胃中原蟲數(shù)量以及黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、普雷沃氏菌和反芻獸新月單胞菌的相對(duì)含量，降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對(duì)含量。高劑量組的瘤胃中原蟲數(shù)量顯著高于其他2組(P<0.05)，但其他2組間差異不顯著(P>0.05)。高劑量組瘤胃中黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、普雷沃氏菌的相對(duì)含量顯著高于其他2組(P<0.05)，反芻獸新月單胞菌相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。低劑量組的反芻獸新月單胞菌的相對(duì)含量也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且與高劑量組差異不顯著(P>0.05)。

表3　地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同粗飼料干物質(zhì)瘤胃降解參數(shù)的影響

a為快速降解部分，b為慢速降解部分，c為慢速降解部分的降解速率，a+b為可降解部分。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

a was the fraction of immediately degraded, b was the fraction of slowly degraded, c was degradation rate of fraction of slowly degraded, and a+b was the degradable fraction. Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4　地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同粗飼料中性洗滌纖維瘤胃降解參數(shù)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items對(duì)照組Controlgroup低劑量組Low?dosegroup高劑量組High?dosegroupSEMP值P?value有效降解率ED/%27．8b30．36b34．21a1．670．046苜蓿Alfalfaa/%4．814．608．631．000．060b/%54．6955．3059．461．890．250c/(%/h)4．274．434．940．420．180a+b/%59．50b59．90b68．08a2．050．030有效降解率ED/%32．55b33．54b41．46a0．540．002

表5　地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)不同飼料粗蛋白質(zhì)瘤胃降解參數(shù)的影響

3　討　論

3.1地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)粗飼料瘤胃降解參數(shù)的影響

干物質(zhì)瘤胃降解率是影響奶牛干物質(zhì)采食量和評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要因素，它能夠反映飼料在瘤胃內(nèi)的利用程度[26-27]，主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等物質(zhì)的降解。本試驗(yàn)中，ATC提高了玉米青貯干物質(zhì)的有效降解率和慢速降解部分的降解速率，可能與瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量和菌群作用有關(guān)。張立霞等[28]和胡靜等[1]指出瘤胃微生物對(duì)底物的附著能力和微生物數(shù)量的增加對(duì)飼糧的降解速率和降解程度十分重要。本試驗(yàn)中，ATC增加了瘤胃內(nèi)原蟲的數(shù)量，也提高了部分纖維降解菌(白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌)和非纖維降解菌(普雷沃氏菌和反芻獸新月單胞菌)的相對(duì)含量，使得瘤胃微生物的降解作用增強(qiáng)，增殖所需的骨架原料和能量來(lái)源增加，從而促進(jìn)了飼糧干物質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)成分的消化和利用[29]。

表6　地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響

飼料中不溶于中性洗滌劑的物質(zhì)是NDF，是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、硅酸鹽以及細(xì)胞壁間的蛋白質(zhì)。改善瘤胃發(fā)酵功能有益于提高飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃降解率[30]。本試驗(yàn)中，高劑量組中3種粗飼料NDF的瘤胃有效降解率和羊草NDF的慢速降解部分的降解速率以及苜蓿NDF的可降解部分含量均得到顯著提高，可能是由于ATC改善了奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境。Yeo等[9]通過(guò)體外發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌絲能夠顯著提高體外產(chǎn)氣量和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，有效改善了瘤胃內(nèi)環(huán)境，并提高了體外纖維素濾紙的降解率，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是主要的3種纖維降解菌。ATC的添加雖然降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)含量，但是提高了黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的相對(duì)含量，同時(shí)，原蟲的數(shù)量也得到顯著提高。原蟲能夠產(chǎn)生纖維素酶，將飼料纖維消化降解，并產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸。原蟲裂解纖維素，然后通過(guò)吞噬纖維素，在纖維素酶的作用下將其降解成單糖，為動(dòng)物機(jī)體供能[31]。原蟲能夠降解總纖維量超過(guò)30%，Coleman[32]也認(rèn)為，原蟲是瘤胃纖維降解的主要酶源，瘤胃去原蟲后，綿羊瘤胃纖維素降解率降低50%。因此，本試驗(yàn)中，高劑量組的原蟲數(shù)量的提高也是導(dǎo)致粗飼料NDF有效降解率提高的重要原因。

飼料蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解情況主要取決于其發(fā)酵的難易程度和在瘤胃內(nèi)的滯留時(shí)間[33]。本試驗(yàn)中，高劑量組中具有蛋白質(zhì)降解作用的普雷沃氏菌和反芻獸新月單胞菌的相對(duì)含量均顯著增加。普雷沃氏菌是廣泛存在于瘤胃且數(shù)量最多的一類細(xì)菌。其中，棲瘤胃普雷沃氏菌被認(rèn)為是數(shù)量最多的蛋白質(zhì)降解菌，在不同比例的精粗飼糧條件下反芻動(dòng)物都會(huì)存在該屬的蛋白質(zhì)降解菌株，在飼料蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用[34]。反芻獸新月單胞菌除了在調(diào)節(jié)乳酸代謝、降低乳酸積累中有重要作用，還是重要的蛋白質(zhì)降解菌。原蟲也是蛋白質(zhì)降解過(guò)程中的積極參與者，其降解不溶性蛋白質(zhì)的能力和蛋白質(zhì)降解酶的活性都要高于細(xì)菌[35]。因此，本試驗(yàn)中，瘤胃蛋白質(zhì)降解菌和原蟲的共同作用使得高劑量組中玉米青貯和苜蓿粗蛋白的有效降解率得到顯著提高。同時(shí)，瘤胃微生物對(duì)飼料粗蛋白質(zhì)的降解速率和降解程度也有積極影響，使得羊草和青貯的慢速降解部分、可降解部分和快速降解部分得到顯著提高。ATC為粗飼料的蛋白質(zhì)降解創(chuàng)造了良好的發(fā)酵環(huán)境，使得發(fā)酵程度更高，降解率更高。

3.2地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃內(nèi)的微生物主要包括瘤胃細(xì)菌、原蟲和真菌等。對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，粗飼料的消化利用與瘤胃微生物的數(shù)量和組成有著十分密切的關(guān)系[1]。瘤胃微生物將粗飼料中的纖維類物質(zhì)降解，從而轉(zhuǎn)化為反芻動(dòng)物自身必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[36]。同時(shí)，瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量的多少對(duì)飼糧纖維和蛋白質(zhì)的降解也具有重要意義[31-32]。本試驗(yàn)中，添加ATC增加了部分纖維降解菌和其他瘤胃細(xì)菌和原蟲的數(shù)量，但降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)含量。前人研究報(bào)道了擁有相同功能性成分(蟲草素)的蟲草菌絲和某些次級(jí)代謝產(chǎn)物同樣具有抑制產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的生長(zhǎng)的作用[10,37]，機(jī)制尚不清楚。但這一結(jié)果十分重要，它證明了ATC能夠調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)某些纖維降解菌和非纖維降解菌的數(shù)量，從而為ATC改變粗飼料各營(yíng)養(yǎng)成分瘤胃有效降解率提供合理的解釋。已有報(bào)道證明，蟲草類物質(zhì)及其功能性成分具有增加益生菌數(shù)量的潛力[38]，而對(duì)腸道有害菌也有選擇性的生長(zhǎng)抑制作用[39-40]。Yeo等[11]也通過(guò)體外發(fā)酵試驗(yàn)證明了，蛹蟲草菌絲能夠增加瘤胃內(nèi)總細(xì)菌數(shù)量、纖維降解菌數(shù)量和纖維酶活性。因此，可以推測(cè)ATC能夠刺激部分瘤胃細(xì)菌和原蟲的生長(zhǎng)，從而提高飼糧蛋白質(zhì)和碳水化合物的進(jìn)一步降解，來(lái)提高飼料在瘤胃內(nèi)的降解率。但ATC對(duì)瘤胃微生物發(fā)揮作用的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)　論

本試驗(yàn)條件下，地頂孢霉培養(yǎng)物能夠調(diào)節(jié)部分瘤胃微生物的菌群數(shù)量并提高粗飼料的瘤胃降解率，其中以30 g/(d·頭)添加量為宜。

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(責(zé)任編輯王智航)

Effects ofAcremoniumterricolaCulture on Ruminal Degradation Parameters of Roughages and Microflora of Dairy Cows

LI YangZHANG XingyiZHANG GuangningWANG YizhenLIN CongXU HongjianJIANG XinLIU ShuaiZHANG Yonggen*

(College of Animal Science and Technology， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China)

This experiment was conducted to study the effects ofAcremoniumterricolaculture (ATC) on ruminal degradation parameters of roughages and microflora of dairy cows. Three ruminally cannulated multiparous Holstein cows averaging 650 kg of body weight were used in a 3×3 Latin square design. Dairy cows in different groups were fed basal diets supplemented with 0 (control group), 15 (low-dose group) and 30 g/(d·cow) ATC (high-dose group), respectively; The experiment consisted of 3 periods with 27 days per period, and each period consisted of a 15-day pre-test period and 12-day test period. The changes of ruminal degradation parameters of Chinese wildrye, corn silage and alfalfa hay, and ruminal microflora were determined. The results showed as follows: 1) compared with control group, effective degradability and degradation rate of fraction of slowly degraded of dry matter of corn silage in high-dose group were significantly increased (P<0.05); effective degradability of neutral detergent fiber of three kinds of roughages in high-dose group was significantly higher than that of the other groups (P<0.05), and degradation rate of fraction of slowly degraded of neutral detergent fiber of Chinese wildrye and degradable fraction content of neutral detergent fiber of alfalfa hay in high-dose group were significantly higher than those of the other groups (P<0.05); compared with control group, effective degradability and the content of fraction of immediately degraded of crude protein of corn silage in high-dose group were significantly increased (P<0.05), effective degradability of crude protein of alfalfa hay in test groups was significantly increased (P<0.05); the contents of fraction of immediately degraded and degradable fraction of Chinese wildrye in high-dose group were significantly increased (P<0.05), but effective degradability was not affected (P>0.05). 2) Compared with control group, ruminal protozoal population and the relative contents ofRuminococcusflavefaciens,RuminococcusalbusandPrevotellain high-dose group were significantly increased (P<0.05), and the relative content ofSelenomonasruminantiumin test groups was significantly increased (P<0.05), however, the relative content ofFibrobactersuccinogenesin high-dose group was significantly decreased (P<0.05). Therefore, under the conditions in the present study, ATC may adjust contents of certain rumen microbes and improve degradability of roughages of dairy cows， and the suitable recruitment is 30 g/(d·cow).[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3238-3247]

Acremoniumterricolaculture; dairy cow; roughage; rumen degradability; microflora

, professor, E-mail: zhangyonggen@sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.027

2016-03-28

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-37)

李洋(1989—)，男，黑龍江肇東人，博士研究生，從事反芻動(dòng)物生產(chǎn)的研究。E-mail: 446190229@qq.com

張永根，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhangyonggen@sina.com

S823;S816.7

A

1006-267X(2016)10-3238-10