激活Shh信號通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的研究

孫亞超，王靜東，金　博，孫振強，方　法，王琦三

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腹外科，烏魯木齊　830011；2武警新疆總隊醫(yī)院普外科，烏魯木齊　830096)

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激活Shh信號通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的研究

孫亞超1，王靜東2，金博1，孫振強1，方法1，王琦三1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腹外科，烏魯木齊830011；2武警新疆總隊醫(yī)院普外科，烏魯木齊830096)

目的闡釋激活Shh信號通路對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。 方法常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞，設(shè)立對照組(培養(yǎng)液中加入PBS)、實驗組(即信號通路活化，培養(yǎng)液中加入重組Shh配體)；采用Westen-blot檢測E-cadherin和Vimentin 蛋白表達水平的變化；RT-PCR檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin 在mRNA水平的變化；行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化的改變。結(jié)果Westen-blot檢測蛋白提示，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中，Shh信號通路激活可促進Vimentin蛋白表達(P<0.05)，抑制E-cadherin蛋白表達(P<0.05)；RT-PCR檢測:實驗組中E-cadherin和Vimentin的mRNA表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與對照組相比較，實驗組的Vimentin的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，E-cadherin的表達量明顯降低(P<0.05)；HE細(xì)胞染色提示對照細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間更緊密地連接，并與信號通路阻斷組細(xì)胞無顯著差異，而實驗組細(xì)胞呈橢圓形或圓形，連接疏松，部分細(xì)胞呈團簇集群樣生長。結(jié)論EMT在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，而Shh信號通路的激活可促進結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生、發(fā)展。

上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化；Shh信號通路；結(jié)腸癌；E-cadherin和Vimentin

上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指在某些特殊的病理或者生理條件下，具有極性的上皮細(xì)胞失去極性，失去與細(xì)胞基底膜的密切聯(lián)系，進而轉(zhuǎn)化為具有較強活動能力、獲取較高的遷移與侵襲力,而且還能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)表型細(xì)胞的復(fù)雜過程。近年來的眾多研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著十分密切的聯(lián)系，其在結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的原位浸潤和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織及體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中也存在著上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[2-3]。目前鮮見Shh信號通路與結(jié)腸癌上皮間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究報道，Shh信號的激活在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中是否可以促進結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT 的過程目前尚不十分清楚。本研究旨在通過對結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞發(fā)生EMT過程中的2個重要標(biāo)志蛋白分子E-cadherin(鈣黏附蛋白-E)和Vimentin(波形蛋白)的表達質(zhì)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)改變結(jié)果進行分析，進一步探索Shh信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的過程中，上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的作用及影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、PBS溶液、Shh配體、RPMI1640稀釋的人工基質(zhì)Matrigel、HE、RT-PCR試劑盒(FSK.100)TOYOBO公司，Westen-blot試劑盒(北京集思佳揚生物有限公司)。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國THERMO ELECTRON公司)，超凈工作臺(青島海爾公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)，SpectraMax 190連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國MD公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，超低溫冰箱(美國THERMO ELECTRON公司)，電熱恒溫水浴箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，低溫超速離心機和低速離心機(日本Hitachi公司)，高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療有限公司)

1.2實驗方法

1.2.1Westen-blot法檢測E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平采集細(xì)胞，運用蛋白提取液煮沸法提取細(xì)胞總蛋白，采用Lowry法測定各樣品的濃度，每個樣品上樣30 μg，SDS-PAGE蛋白電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次緩慢加入Shh一抗(鼠單抗)和二抗(羊抗鼠IgG)，然后于ECL液溫浴，時間為2 min，之后行X線片曝光顯影，使用激光光密度圖像掃描儀檢測各組信號條帶的吸光值并記錄。

1.2.2RT-PCR法檢測E-cadherin和Vimentin 在mRNA水平的變化表達的差異：細(xì)胞生長至80%融合時，對照組在培養(yǎng)液中加入PBS,實驗組在培養(yǎng)液中加入重組Shh配體，使終濃度為100 nmoL/L，與細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h。按TRIzol總RNA提取試劑盒(Promega)說明書提取細(xì)胞總RNA，參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶RT-PCR試劑盒(Promega)說明書，分別以E-cadherin、Vimentin和GAPDH引物進行RT-PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線凝膠成像分析儀照相，觀察E-cadherin、Vimentin和GAPDH產(chǎn)物條帶的位置并分析吸光度值。重復(fù)實驗3次。

1.2.3HE染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)變化制作細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3 次，95%酒精進行固定，時間為10 min，然后再用PBS洗滌3 次，規(guī)范行伊紅、蘇木素染色，緩慢逐級乙醇脫水，采用二甲苯透明，中性樹脂封片，取切片于光鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.1Westen-blot法檢測蛋白表達實驗發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組細(xì)胞中的Vimentin表達明顯升高，E-cadherin表達降低(圖1)。

圖1　對照組和實驗組2種蛋白表達(GAPDH作為內(nèi)參照)

2.2RT-PCR法檢測結(jié)果實驗組結(jié)腸癌細(xì)胞Vimentin的mRNA相對表達量顯著高于對照組，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組E-cadherin的mRNA相對表達量較對照組降低(P<0.05)。同時，激活Shh信號通路后，結(jié)腸癌細(xì)胞中的E-cadherin和Vimentin的mRNA水平相對表達量之間也有明顯差異，即Vimentin 的mRNA表達水平偏高，E-cadherin的mRNA表達水平偏低，見圖2。

圖2　E-cadherin和Vimentin的 mRNA水平的相對表達量

2.3細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)變化對照組細(xì)胞呈梭形,大小不一,連接緊密；實驗組細(xì)胞多呈橢圓形或圓形，連接疏松，細(xì)胞間接觸減小，部分呈團簇集群狀生長(圖 3)。

圖3細(xì)胞HE染色(×200)

3　討論

Jemal等[5]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因，90%確診實體惡性腫瘤的患者因為腫瘤病灶遠處轉(zhuǎn)移侵襲靶組織或器官引起相應(yīng)組織、器官損害甚至功能衰竭而死亡。在許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Shh信號通路的異常激活扮演著很重要的角色，包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多數(shù)腫瘤組織中皆能夠檢測到Shh信號通路的過度激活表達現(xiàn)象[6-7]。Shh 是胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號能夠通過成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowth factor，F(xiàn)GF)、TGF-β、Notch 等一系列細(xì)胞信號通路的激活可間接導(dǎo)致EMT 的發(fā)生[8-9]。同時，大量的研究也表明上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化在上皮性腫瘤(包括結(jié)腸癌)的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。Greenburg等[11]于 1982 年首次提出 EMT 的概念，EMT 最初被認(rèn)定是胚胎發(fā)生的一個特征，與胚胎的組織和器官發(fā)育有密切關(guān)系，其對原腸胚的形成、心臟瓣膜的形成、神經(jīng)嵴的形成、肌細(xì)胞形成等一系列的組織、器官生長發(fā)育過程具有重要的影響[12]。Theiry[1]于2002年研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移之前，腫瘤細(xì)胞能夠通過EMT獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。此后，腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生就成為了腫瘤轉(zhuǎn)移的重要理論解釋，慢慢被人們所接受與研究。另外，Kang等[13]研究認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，E-cadherin(鈣黏附蛋白-E)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的主要關(guān)鍵標(biāo)志分子，并在其中發(fā)揮著重大作用。在E-cadherin功能具備的狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞會相互黏附、緊密相貼，當(dāng)出現(xiàn)E-cadherin表達水平下降的情況時，腫瘤上皮細(xì)胞就會發(fā)生EMT，使得具備遷移能力和運動活性增強的腫瘤細(xì)胞能夠向遠處遷行移動，最終在靶組織或器官形成新的轉(zhuǎn)移灶。在細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中還有一種關(guān)鍵蛋白即Vimentin(波形蛋白)發(fā)生改變，在結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌等許多腫瘤中，這些發(fā)生上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，Vimentin的表達量會顯著升高，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也會隨之顯著地增強[10-14]。波形蛋白是細(xì)胞中間絲的一種重要纖維蛋白，大多數(shù)在間葉組織中表達出現(xiàn)，其生物學(xué)功能被認(rèn)為是維持細(xì)胞和細(xì)胞器的形態(tài)，參與、構(gòu)造細(xì)胞骨架與胞膜的形成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的波形蛋白表達增強，將會引起細(xì)胞骨架重新排列，進而形成細(xì)胞-基質(zhì)黏附，最終能夠改變細(xì)胞表型和增強細(xì)胞遷行運動的能力。本實驗研究顯示，通過采用重組Shh配體來激活Shh信號通路后，運用Westen-blot方法檢測和RT-PCR方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29 細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin2種蛋白表達及其mRNA表達水平的變化發(fā)現(xiàn)，信號通路活化組顯著表達Vimentin，同時，本實驗也發(fā)現(xiàn)，激活Shh信號通路后，實驗組細(xì)胞的E-cadherin分子蛋白表達水平降低，且與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此進一步推測，激活Shh信號通路后，結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。

惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個多基因、多因素、多步驟的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞從腫瘤原發(fā)部位脫離，進入周圍基質(zhì)，進而移行進入淋巴系統(tǒng)或循環(huán)系統(tǒng)，黏附在淋巴管或血管內(nèi)皮細(xì)胞壁并向脈管外遷行移動，一步一步侵入到轉(zhuǎn)移組織或器官，進行血管的增生，從而在新的部位形成新的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶引起相應(yīng)組織、器官的病變損害。在這個過程中，腫瘤病灶由原發(fā)部位游離是腫瘤轉(zhuǎn)移最初始的因素，同時也是腫瘤離開原發(fā)部位向遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展形成新的轉(zhuǎn)移灶的重要先決條件[15]。而當(dāng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，會導(dǎo)致細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞體積伸展變長類似成纖維細(xì)胞樣，并與周圍的細(xì)胞和基質(zhì)接觸面積縮小，進而引起細(xì)胞間的黏附力和相互作用力減弱，使得細(xì)胞相對自由，其遷移和運動的能力得到增強，同時發(fā)生細(xì)胞生物標(biāo)記物的改變，即減弱甚至喪失了上皮表型，如E-cadherin；而擁有間質(zhì)表型，如Vimentin，其中E-cadherin 的表達缺失已被多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生EMT的重要典型標(biāo)志之一[16]。參考相關(guān)文獻報道及結(jié)合本研究結(jié)果，思考Shh信號通路調(diào)控結(jié)腸癌EMT的發(fā)生是否引起結(jié)腸癌細(xì)胞的遠處遷移，通過對兩組結(jié)腸癌細(xì)胞給予不同的處理后，經(jīng)HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，信號通路活化組細(xì)胞形態(tài)大部分呈類圓形或圓形、大小不等、細(xì)胞間連接較疏松，部分細(xì)胞呈團簇集群狀生長。另外，結(jié)合本實驗上述的研究結(jié)果即信號活化組細(xì)胞中Vimentin的高表達和E-cadherin 的低表達，由此推測出信號活化組細(xì)胞經(jīng)激活Shh信號通路后，細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引起間質(zhì)表型Vimentin的高表達。同時，細(xì)胞骨架是由微管、微絲和中間絲構(gòu)成，細(xì)胞形態(tài)與之密切相關(guān)，另外細(xì)胞骨架還參與了細(xì)胞的移行、運動、信息傳遞、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及細(xì)胞分裂、分化及基因表達等多種功能表達的過程。另外，Pawlak等[17]研究闡釋，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的這種Vimentin高表達會破壞細(xì)胞黏著斑，細(xì)胞骨架重新排列，從而改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，這種變化會使細(xì)胞胞體的剛性降低，增強順應(yīng)性，細(xì)胞更容易在組織中變形游走，這最終會引導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位向遠處遷行與侵襲的能力得到增強引起腫瘤轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果提示，激活Shh信號通路可導(dǎo)致結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞上皮表型發(fā)生改變、形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時也說明了細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，上皮組織趨向于間質(zhì)表型發(fā)展，其變形能力及順應(yīng)性增加，增強了細(xì)胞移行運動的能力，為細(xì)胞脫離原發(fā)部位向遠處遷移提供了一定的基礎(chǔ)條件。

綜上所述，本研究認(rèn)為激活Shh信號通路能夠使結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，而這種高表達Vimentin和低表達E-cadherin的細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)合2種蛋白分子的特性很大程度上能夠增強細(xì)胞的遷移運動能力。因此推測重組Shh活化配體激活Shh信號通路可以通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞極性喪失，失去與基底膜的聯(lián)系，細(xì)胞體積伸展變長，與周圍的細(xì)胞及基質(zhì)接觸面縮小，細(xì)胞間黏附的能力和相互作用降低，進而引起發(fā)生EMT的細(xì)胞運動和遷移能力得到顯著增強，這一系列的改變很可能為腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位向遠處轉(zhuǎn)移、侵入靶組織或器官奠定了基礎(chǔ)。至于Shh信號通路的激活對結(jié)腸癌EMT的發(fā)生之后細(xì)胞如何轉(zhuǎn)移、侵襲的具體確切發(fā)生、發(fā)展機制尚待進一步科學(xué)實驗研究。

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(本文編輯張巧蓮)

The effect of activating Shh signaling pathway on epithelial-mesenchymal transition of colon cancer cells activating

SUN Yachao1,WANG Jingdong2,JIN Bo1,SUN Zhenqiang1,FANG Fa1,WANG Qisan1

(1Department of Gastrointestinal Surgery,Affiliated Tumor Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China；2Department of General Surgery,Xinjiang Uyger Autonomous Region Corps Hospital,Chinese People′s Armed Poloce Force,Urumqi 830096,China)

ObjectiveTo explain effect of Shh signaling pathway on epithelial-mesenchymal transition (EMT)of colon cancer cells.MethodsRoutinely cultured colon cancer HT-29 cells were devided intocontrol group (PBS in broth) and testing group (recombinant shh ligand in PBS)；After 24 h of transfection ,cultured cells were harvested to detect the changes of E-cadherin and Vimentin protein by RT-PCR and Western-blot,respectively．The morphological changes of the cells were observed by HE staining.Res-ultsWesten-blot analysis showed that activation of Shh signaling pathway can promote the expression of Vimentin (P<0.05)and inhibit the E-cadherin protein expression (P<0.05) in colon cancer HT-29 cells; Compared with control group,the mRNA expression of Vimentin significantly increased (P<0.05) and the expression of E-cadherin significantly decreased (P<0.05) in the experimental group; HE staining showed that the cell of control group were fusiform ,closely connected,and had no significant difference with the signal path blocking group ,however，the signaling pathway activated cells were round or oval,loose connection,and some were clustered.ConclusionEMT plays an important role in colon cancer metastasis,and activating the Shh signaling pathway can promote the EMT of colon cancer cell.

Epithelial-mesenchymal transition ; Shh signaling pathway; colon cancer; E-cadherin and Vimentin

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2013211A066)

孫亞超(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：胃腸腫瘤的基礎(chǔ)研究與防治。

王琦三，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：胃腸腫瘤的基礎(chǔ)研究與防治，E-mail:370731493@qq.com。

R34

A

1009-5551(2016)11-1428-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.020

2016-03-19]