應(yīng)用液相阻斷ELISA試驗(yàn)和正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測豬O型口蹄疫抗體的比較分析

劉　陽，韋選民，張智鵬，李艷明，熊偉曼，張　靖，趙　力

（陜西省漢中市動物疾病預(yù)防控制中心，陜西 漢中 723000）

應(yīng)用液相阻斷ELISA試驗(yàn)和正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測豬O型口蹄疫抗體的比較分析

劉陽，韋選民，張智鵬，李艷明，熊偉曼，張靖，趙力

（陜西省漢中市動物疾病預(yù)防控制中心，陜西 漢中 723000）

口蹄疫，是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達(dá)70多種，主要侵害偶蹄類動物，少見于人。豬口蹄疫是國家要求強(qiáng)制免疫的重大動物疫病之一，對其免疫抗體檢測的科學(xué)、準(zhǔn)確性對有效防控口蹄疫尤為重要，但在實(shí)際檢測過程中，常因檢測方法不同而使檢測結(jié)果有所差異，即使同一份血清用不同檢測方法，其監(jiān)測結(jié)果不一致的現(xiàn)象時有發(fā)生。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測豬O型口蹄疫抗體的方法，主要有液相阻斷ELISA試驗(yàn)和正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）。液相阻斷ELISA試驗(yàn)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的抗體合格判定標(biāo)準(zhǔn)與試劑盒說明書一致，IHA試驗(yàn)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的抗體合格判定標(biāo)準(zhǔn)與試劑盒說明書存在差異，在實(shí)際檢測過程中，無論IHA采用哪種結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，二者檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象時有發(fā)生。為此本試驗(yàn)選擇這兩種方法分別對284份豬血清樣品進(jìn)行O型口蹄疫免疫抗體平行對比檢測，針對不同的（IHA）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)比較二者檢測結(jié)果的一致性，從而找出影響兩種檢測方法結(jié)果一致的因素，對兩種方法提出較為客觀、公正的評價，為實(shí)驗(yàn)室口蹄疫抗體檢測方法的選擇提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品血清樣品來自口蹄疫疫苗比對試驗(yàn)所采豬血清，共檢測豬血清284份。

1.2試劑口蹄疫O型正向間接血凝抗體檢測試劑盒，批號2014081804。口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批號：2014063001，抗原批號：2014062501，抗原使用濃度1∶11。以上均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3儀器設(shè)備單道、8道微量移液器，均購自德國Brand公司；酶標(biāo)儀型號為MULTISKAN FC，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱型號為DHP-9162，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；超純水儀型號為UPH-11-20T，成都超純科技有限公司生產(chǎn)。

1.4檢測方法與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)正向間接血凝試驗(yàn)按試劑盒說明書進(jìn)行操作。按農(nóng)業(yè)部［農(nóng)醫(yī)發(fā)（2012）2號］文件要求，判定標(biāo)準(zhǔn)：其有效抗體≥1∶32（第5孔）呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格；按中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所試劑說明書要求，判定標(biāo)準(zhǔn)：其有效抗體效價≥1∶128（第7孔），呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格。

液相阻斷ELISA試驗(yàn)按試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，波長492 nm，病毒抗原對照D492 nm在1.5±0.5范圍內(nèi)，陽性對照抗體效價在1∶1024±1滴度以內(nèi)，陰性對照血清抗體效價＜1∶8，試驗(yàn)算成立。樣品結(jié)果判定方法依據(jù)試劑盒說明書結(jié)果判定方法進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)：豬血清抗體效價≥1∶64為免疫合格（與農(nóng)業(yè)部規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)一致）。

2　結(jié)果與分析

2.1ELISA和IHA不同判定標(biāo)準(zhǔn)樣品合格率的比較由表1可見，總樣本液相阻斷ELISA試驗(yàn)的合格率為44.72%（127/284）；正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）按農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)（抗體滴度≥25）的合格率為66.20%（188/284），按試劑說明書要求（抗體滴度≥27）的合格率為20.77%（59/284），按本試驗(yàn)設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)（抗體滴度≥26）的合格率為41.20%（117/284）。由此可見，農(nóng)業(yè)部要求的正向間接血凝（IHA）的檢測合格率明顯高于液相阻斷ELISA的檢測合格率，誤差率高達(dá)21.48%（61/284），經(jīng)X2檢驗(yàn)差異極顯著（P＜0.01），其結(jié)果與周家喜等［1］、陳桂英［2］的試驗(yàn)結(jié)果一致；按試劑盒說明書要求的正向間接血凝試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，其檢測合格率明顯低于液

相阻斷ELISA的檢測合格率，誤差率23.59%（68/ 284），經(jīng)X2檢驗(yàn)差異極顯著（P＜0.01）。而按本試驗(yàn)設(shè)計的正向間接血凝試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，其檢測合格率與液相阻斷ELISA試驗(yàn)基本一致，誤差率僅為3.52%（10/284），經(jīng)X2檢驗(yàn)差異不顯著（P＞0.05）。說明以本試驗(yàn)設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)為IHA判定標(biāo)注，其檢測合格率與液相阻斷ELISA試驗(yàn)基本一致，過高或過低的IHA判定標(biāo)準(zhǔn)都會影響其與ELISA合格率的一致性。

2.2ELISA與IHA重復(fù)性比較由表2可見，在284份樣品中，ELISA方法檢測合格127份，同時IHA方法檢測合格108份（抗體滴度≥25）或45份（抗體滴度≥27），ELISA方法檢測不合格157份，同時IHA方法檢測不合格81份（抗體滴度＜25）或147份（抗體滴度＜27）；總樣本中兩種檢測方法相一致的符合率為66.55%（189/284）、67.61%（192/284）。說明IHA方法與ELISA方法檢測數(shù)的符合率差異，與IHA采用不同的抗體合格判定標(biāo)準(zhǔn)無關(guān)。

表1　284份樣品ELISA和IHA檢測結(jié)果比較　單位：份、%

表2　ELISA與IHA不同判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果符合率比較

2.3IHA抗體滴度與ELISA相關(guān)性的分析由表3可見，在以抗體滴度≥25為判定標(biāo)準(zhǔn)的IHA檢測合格188份中，同時ELISA檢測不合格78份，誤差率41.49%（78/188）；在以抗體滴度≥27為判定標(biāo)準(zhǔn)的IHA檢測合格59份，同時ELISA檢測不合格10份，誤差率16.95%（10/59），其中有2份抗體滴度在7孔以上，ELISA檢測卻不合格。說明IHA檢測判定標(biāo)準(zhǔn)越高，與ELISA合格數(shù)的誤差率越低，同時也說明ELISA檢測方法同樣也會出現(xiàn)一定誤差。

2.4IHA抗體滴度大小與ELISA抗體滴度相關(guān)性比較由表4可得，用IHA檢測抗體滴度≥25，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共56份，其中有37份ELISA檢測抗體滴度在1∶45-1∶90之間，占總樣品的66.07%（37/56）；用IHA檢測抗體滴度≥26，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共54份，其中有32份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的59.26%（32/54）；用IHA檢測抗體滴度≥27，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共32份，其中有26份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的81.25%（26/ 32）；用IHA檢測抗體滴度≥28，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共11份，其中有10份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的90.91%（10/11）；用IHA檢測抗體滴度≥29，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共12份，其中有12份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的100%（12/12）。說明用IHA檢測樣品抗體滴度越高，用ELISA檢測抗體滴度也越高。

表3　IHA抗體滴度大小ELISA合格數(shù)的誤差關(guān)系

由表5可見，ELISA檢測出的相同抗體滴度的樣品，再用IHA檢測抗體滴度分布范圍較廣，但絕大多數(shù)分布在相近的抗體滴度范圍內(nèi)，同時ELISA檢測抗體滴度越高，IHA檢測抗體滴度也越高。

表4　IHA檢測不同抗體滴度對應(yīng)ELISA檢測結(jié)果分布統(tǒng)計

表5　ELISA抗體滴度大小與IHA抗體滴度相關(guān)性比較

3　討論

3.1按農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，其有效抗體≥25（第5孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率明顯高于ELISA的檢測合格率。若以IHA試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)，其有效抗體≥27（第7孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率又明顯低于ELISA的檢測合格率。而以本試驗(yàn)設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)，其有效抗體≥26（第6孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率與ELISA檢測合格率基本一致，這說明IHA的判定標(biāo)準(zhǔn)對樣品合格率的影響較大，選用合適的IHA判定標(biāo)準(zhǔn)，可以提高這兩種試驗(yàn)檢測結(jié)果的一致性。

3.2在ELISA和IHA的相關(guān)性比較中，IHA判定標(biāo)準(zhǔn)越高，其檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的符合率越高。分析原因，主要是IHA敏感性較高，特異性卻很低，容易產(chǎn)生假陽性，且試驗(yàn)結(jié)果主要通過肉眼觀察，主觀性強(qiáng)；ELISA敏感性較低，特異性卻很高，樣品抗體水平較高時，ELISA更容易檢測出陽性，且試驗(yàn)結(jié)果全部通過儀器測量，人為因素干擾小，結(jié)果準(zhǔn)確性更高。試驗(yàn)中用IHA檢測抗體滴度等于5的樣品共71份，對這71份樣品再用ELISA檢測卻只有29份合格；IHA檢測抗體滴度≥9的樣品共13份，用ELISA檢測時有12份合格，也說明了IHA敏感性高，特異性低，會產(chǎn)生假陽性，ELISA敏感性較低，特異性較高。

3.3IHA檢測出的不同抗體滴度的樣品，再用ELISA檢測，抗體滴度分布較廣，但絕大多數(shù)分布在相近的抗體滴度范圍內(nèi)（從表4和表5中可以看出）。分析原因主要是IHA檢測人為因素干擾較大，主觀性較強(qiáng)，存在非特異性凝集，導(dǎo)致IHA檢測抗體滴度很高，ELISA檢測抗體滴度卻很低。

3.4目前IHA試驗(yàn)，仍是我國運(yùn)用最為廣泛的口蹄疫免疫抗體監(jiān)測方法，這也是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法之一，而液相阻斷ELISA方法作為一種生物學(xué)方法，也常常被用來檢測其抗體，同時也是國家推薦使用的方法。IHA的原理是利用提純的口蹄疫病毒致敏于醛化綿羊紅細(xì)胞上，制成口蹄疫血凝抗原，用于檢測血清中的抗體水平。該方法簡單易行，適合于基層單位應(yīng)用，但特異性低，有假陽性現(xiàn)象。在國際上該方法已不再使用。液相阻斷ELISA試驗(yàn)原理是抗原抗體在液相中反應(yīng)，與病毒中和試驗(yàn)原理相似，又被稱為體外病毒中和試驗(yàn)，是國際獸醫(yī)局（OIE）推薦的監(jiān)測口蹄疫病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。

4　結(jié)論

（1）IHA試驗(yàn)使用儀器設(shè)備少，操作簡便快速，試劑盒價格低廉；而ELISA試驗(yàn)，要求技術(shù)人員操作熟練，使用儀器設(shè)備多，操作步驟繁瑣，耗時較長，且試劑價格昂貴。在基層運(yùn)用較多的還是IHA試驗(yàn)，而且IHA也是國家允許使用的口蹄疫抗體檢測方法，因此在基層，實(shí)驗(yàn)條件不好的地方，如能科學(xué)地應(yīng)用，IHA方法仍不失為基層較好的檢測方法；在小范圍抽樣下，實(shí)驗(yàn)條件較好的地方，應(yīng)使用OIE標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中均采用的液相阻斷ELISA方法［3］。

（2）從診斷試劑穩(wěn)定性來看，ELISA試劑性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，而IHA試劑性能穩(wěn)定性不夠好，重復(fù)性差。因此，基層采用IHA來評估口蹄疫免疫抗體水平，需要提高檢測技術(shù)和判定標(biāo)準(zhǔn)，以減少誤判。

（3）在每年的重大動物疫病防控效果考評中，政府都要投入大量的人力、物力、財力進(jìn)行抽樣檢測，評估免疫效果，但檢測結(jié)果常因檢測方法或檢測試劑不同而不盡一致，給免疫效果評估工作帶來了不便，同時也干擾了口蹄疫的防控工作。因此，選擇一種可靠的、通用的口蹄疫免疫抗體檢測方法來指導(dǎo)基層動物防疫工作，科學(xué)準(zhǔn)確評價動物群體免疫狀況和抗感染能力，才能最終達(dá)到有效控制口蹄疫的效果。

［1］周家喜，鄧銓濤，余波，等.豬口蹄疫免疫抗體不同檢測方法的對比試驗(yàn)［J］.中國畜禽種業(yè)，2009（7）：149-150.

［2］陳桂英.不同方法檢測O型口蹄疫免疫抗體的對比試驗(yàn)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（16）：101-102.

［3］GB/T 18935-2003，口蹄疫診斷技術(shù)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003-05-01.

S852.52

B

0529-6005（2016）04-0061-03

2015-01-16

劉陽（1987-），男，助理獸醫(yī)師，本科，主要從事動物疫病防控工作，E-mail：814222659@qq.com

韋選民，E-mail：fffsys2255543@126.com