豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

李　爽，元娜，張　杏，張志剛，肖　軍，蘇敬良，金忠輝，

（1.北京偉嘉集團(tuán)創(chuàng)新研究院，北京 昌平 102206；2.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063000；3.北京偉嘉動(dòng)物健康檢測(cè)與評(píng)價(jià)中心，北京 通州 101105；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

李爽1，2，元娜1，3，張杏1，張志剛1，肖軍3，蘇敬良4，金忠輝1，4

（1.北京偉嘉集團(tuán)創(chuàng)新研究院，北京 昌平 102206；2.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063000；3.北京偉嘉動(dòng)物健康檢測(cè)與評(píng)價(jià)中心，北京 通州 101105；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

從河北廊坊養(yǎng)豬場(chǎng)采集有明顯呼吸道癥狀的豬肺臟進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、16S rRNA測(cè)定，以及支氣管敗血波氏桿菌fla及Dnt基因PCR鑒定，確定成功分離鑒定到4株豬支氣管敗血波氏桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)慶大霉素、替米考星、氟苯尼考、恩諾沙星及頭孢吡肟高度敏感。對(duì)小鼠具有一定致病性。

豬源支氣管敗血波氏桿菌；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)

豬支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiesptica，Bb）是豬傳染性萎縮性鼻炎的主要病原菌，單獨(dú)或與產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌混合感染可引起豬的萎縮性鼻炎［1-3］。該病呈世界流行，各種年齡的豬都有易感性，特別是幼齡豬對(duì)本病最易感，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)許多地區(qū)有此病的報(bào)道［4-6］。臨床上豬支氣管敗血波氏桿菌多與呼吸道疾病其他致病菌混合感染，如多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，混合感染可提高呼吸道疾病的發(fā)病率并增加疾病的嚴(yán)重程度，給豬場(chǎng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［4-5］。

豬支氣管敗血波氏桿菌具有許多毒力因子，包括粘附素，如絲狀血凝素（filmanetoushemagglutinin，F(xiàn)HA）、百日咳桿菌粘附素（pertactin），還有細(xì)菌毒素，如皮膚壞死毒素（demronecrotietoxin，DNT）、腺苷環(huán)化酶溶血素（adenylate cyclase-hemolisin，Ac-Hly）和氣管細(xì)胞毒素（tracheal cytotoein），以及III型分泌系統(tǒng)［6］。DNT不耐熱，存在于細(xì)菌胞漿內(nèi)，對(duì)福爾馬林敏感，細(xì)菌滅活后仍具有抗原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素中和抗體。研究發(fā)現(xiàn)，DNT毒素可通過(guò)損壞呼吸道內(nèi)保護(hù)層上皮細(xì)胞而促進(jìn)菌株附著作用，另外DNT是Bb定居于上呼吸道所必需的因子［7］。

對(duì)采自河北省廊坊市具有明顯呼吸系統(tǒng)癥狀的豬肺臟臨床樣本進(jìn)行細(xì)菌分離、16S rRNA、fla及Dnt基因PCR鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及小鼠的致死性試驗(yàn)，為豬支氣管敗血波氏桿菌病診斷及臨床治療提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株與材料胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic soyagar，TSA）培養(yǎng)基和（Trypticase Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司；鮑-姜氏（Bodret-Gnegou）培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；TaqDNA聚合酶及基因組提取試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；引物由北京諾賽基因研究中心有限公司合成。

1.2病料采集按常規(guī)方法剖檢病豬，將采集的肺臟劃線(xiàn)接種于含胎牛血清（5%）的TSA平皿，37℃培養(yǎng)24～48 h后觀察，挑取可疑菌落進(jìn)行傳代純化和革蘭染色鏡檢。

1.3細(xì)菌學(xué)檢查及選擇性培養(yǎng)通過(guò)革蘭染色觀察，將陰性可疑菌落劃線(xiàn)接種于普通瓊脂、麥康凱、TSA及鮑-姜氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.416S rRNA基因PCR擴(kuò)增參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行細(xì)菌DNA基因組提取。利用細(xì)菌16S rRNA保守區(qū)域的通用引物（上游：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游：5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大小預(yù)期為750 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃反應(yīng)30 s，退火溫度為52℃45 s，延伸時(shí)間72℃90 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測(cè)序。

1.5fla及Dnt基因PCR鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)合成針對(duì)豬源支氣管敗血波氏桿菌fla及Dnt基因引物（Fla-F：5′-TGGCGCCTGCCCTATC-3′，F(xiàn)la-R：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAA-3′［8］；Dnt-1F：5′-GTGGATAAAGATGAATCGGC-3′，Dnt-1R：5′-TTA ATCAAGTTTGCGTGGCA-3′［6］；Dnt-2F：5′-ATGCTGCTTGGCGACCAGGA-3′，Dnt-2R：5′-CATTCGCTGGGTTTGTACA-3′［9］），以提取細(xì)菌DNA基因組為模板，PCR的反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq Mix 10 μL，下游引物各0.5 μL，模板1 μL，無(wú)菌水8 μL。95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃反應(yīng)30 s，退火溫度為52℃45 s，延伸時(shí)間72℃90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃保溫10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠（EB）染色，凝膠呈像系統(tǒng)掃描照相。

1.6藥敏試驗(yàn)選取分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)進(jìn)行。挑取純化單菌落接種于含5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h。用TSB培養(yǎng)基稀釋菌液至終濃度為3× 108CFU/mL。用滅菌棉拭子在含有胎牛血清的TSA平皿上均勻涂布，待菌液吸收后，貼藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24～48 h后記錄結(jié)果。

1.7小鼠致死試驗(yàn)挑取單菌落，接種于TSB中，于37℃培養(yǎng)16 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，調(diào)整菌數(shù)為1×108CFU/mL，以0.02 mL/只菌液鼻腔接種小鼠5只，同時(shí)設(shè)5只對(duì)照（每只腹腔注射TSB培養(yǎng)基0.02 mL），動(dòng)物房?jī)?nèi)隔離飼養(yǎng)觀察，對(duì)出現(xiàn)癥狀及死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，并采集病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌的分離及培養(yǎng)采集病料接種含血清的TSA平板后長(zhǎng)出數(shù)量不等，大小一致的菌落，菌落呈半透明、凸起、表面光滑菌落，革蘭染色為陰性，球桿狀呈對(duì)排列，無(wú)芽孢。該細(xì)菌在普通瓊脂不生長(zhǎng)，在麥康凱平皿呈白色小菌落，在加入脫纖抗凝血的鮑-姜氏培養(yǎng)基上菌落形成β-溶血環(huán)，從病料中共分離到4株Bb疑似菌，命名為HB-1～HB-4。

2.216S rRNA基因序列對(duì)純化培養(yǎng)的細(xì)菌16S rRNA基因特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在大約750 bp處可見(jiàn)清晰條帶。經(jīng)測(cè)序獲得的16S RNA基因序列與Gen-Bank已公布序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示分離菌株16S rRNA基因序列與多株豬支氣管敗血波氏桿菌（NC_HE965807，NC_JQ953663，NC_JQ953658，NC_KF601903）同源性為99.5%～100%，同源進(jìn)化分析結(jié)果顯示，分離菌株與豬支氣管敗血波氏桿菌處于同一分支（圖1），表明分離菌株為豬支氣管敗血波氏桿菌。

圖1　分離菌株16S rRNA同源進(jìn)化樹(shù)

2.3fla及Dnt基因PCR鑒定對(duì)分離菌進(jìn)行fla及Dnt基因PCR鑒定，結(jié)果顯示，分離菌株fla及Dnt基因檢測(cè)均出現(xiàn)特異性條帶，fla、Dnt1及Dnt2片段大小為237、875及740 bp（圖2）。

2.4藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果分離菌對(duì)阿奇霉素、慶大霉素、替米考星、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星高度敏感；對(duì)諾氟沙星中度敏感；對(duì)阿莫西林、硫酸粘桿菌素低度敏感；對(duì)頭孢曲松鈉不敏感。

圖2　分離菌株fla及Dnt基因PCR鑒定

2.5小鼠的致病性試驗(yàn)小鼠經(jīng)鼻腔接種分離菌后，臨床表現(xiàn)被毛雜亂、精神沉郁，食欲減退，并在72～120 h內(nèi)死亡，對(duì)照組小鼠無(wú)任何臨床異常表現(xiàn)。采集肺臟、肝臟和脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離、PCR鑒定，得到與原分離菌相同的細(xì)菌。

3　討論

支氣管敗血波氏桿菌通常從尸體剖檢及活體拭子中分離進(jìn)行診斷，初次分離時(shí)樣品含菌量少，菌落形態(tài)、生化鑒定上與很多細(xì)菌相似，給臨床的分離工作帶來(lái)一定的困難，導(dǎo)致臨床分離率不高。本試驗(yàn)直接采集患呼吸癥狀的豬肺臟進(jìn)行分離，并根據(jù)特異性基因PCR鑒定及16S rRNA測(cè)序?qū)σ伤萍?xì)菌進(jìn)行鑒定，較活體拭子分離細(xì)菌效率更高且能保證分離的準(zhǔn)確性。有報(bào)道顯示，分離過(guò)程中可用選擇培養(yǎng)基或小鼠傳代的方法能進(jìn)一步提高分離效率［10］。

Bb在普通培養(yǎng)基中均易生長(zhǎng)，如胰蛋白酶大豆瓊脂、麥康凱瓊脂、鮑-姜氏培養(yǎng)基等，但容易發(fā)生菌相變異［10］。蘇雄等利用雙層平板選擇培養(yǎng)基并用雙溫培養(yǎng)法分離Bb，該方法的優(yōu)點(diǎn)是能抑制其他污染雜菌和真菌的生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基配置和培養(yǎng)較繁瑣［11］。楊佩瓊等研究發(fā)現(xiàn)改良Smith培養(yǎng)基對(duì)Bb作分離效果好，另外Bb可以使培養(yǎng)基pH值改變導(dǎo)致顏色變化，易于識(shí)別菌落［12］。本研究比較幾種不同培養(yǎng)基Bb生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，分離菌株在含血清TSA平板及麥康凱生長(zhǎng)較好，鮑-姜氏培養(yǎng)基出現(xiàn)典型的Bb I相菌菌落形態(tài)，證明分離菌為Bb I相菌。

藥物添加能有效地預(yù)防或減輕波氏桿菌病的發(fā)生，但隨著抗菌藥物的大量使用，不斷出現(xiàn)新的耐藥菌株，細(xì)菌的耐藥率也不斷上升。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)阿奇霉素、慶大霉素、替米考星、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星高度敏感；對(duì)諾氟沙星中度敏感；對(duì)阿莫西林、硫酸粘桿菌素低度敏感；對(duì)頭孢曲松鈉不敏感。與最近的報(bào)道結(jié)果相符［3，9］。對(duì)于預(yù)防用藥物應(yīng)有計(jì)劃地定期輪換使用，有條件的豬場(chǎng)最好通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感藥物。

豬支氣管敗血波氏桿菌是一種鼻腔常在菌，從機(jī)體中根除的可能性不大，但對(duì)豬群的危害又不容忽視，其防治工作尤為重要。防治波氏桿菌病主要的手段是進(jìn)行免疫接種配合藥物治療，另外加強(qiáng)管理措施和改善環(huán)境條件同樣能有效降低該病發(fā)病率。通過(guò)細(xì)菌學(xué)方法、血清學(xué)方法以及PCR等途徑對(duì)豬群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰攜帶病原的陽(yáng)性豬，以陰性豬組成基礎(chǔ)豬群，有利于防治波氏桿菌病的發(fā)生。

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S852.61

A

0529-6005（2016）04-0051-03

2014-12-29

李爽（1984-），男，講師，博士，從事動(dòng)物疾病診斷研究，E-mail：lishuang_ncst@163.com

金忠輝，E-mail：jzh@vicagroup.com.cn