豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法的建立

董春娜，肖　進(jìn)，2，張　蕾，巴利民，栗利芳，宋　芳，齊　鵬

（1.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院，北京 豐臺 100070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100093）

豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法的建立

董春娜1，肖進(jìn)1，2，張蕾1，巴利民1，栗利芳1，宋芳1，齊鵬1

（1.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院，北京 豐臺 100070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100093）

根據(jù)豬口蹄疫O型流行毒株VP1序列設(shè)計(jì)出5條合成肽，以固相法合成并以此合成肽作為包被抗原建立豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法，并對該方法敏感性、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：該檢測方法敏感性為96.0%，特異性為99.1%，批內(nèi)與批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于10.0%。比對試驗(yàn)結(jié)果顯示，該檢測方法與UBI豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒符合率為93.2%，與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒符合率為85.7%。該豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法敏感性好、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、操作簡便，可用于檢測O型口蹄疫抗體水平。

口蹄疫；合成肽；抗體；ELISA

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由FMDV感染引起偶蹄動物發(fā)生的烈性傳染病，該病毒傳播途徑多、傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和肉食及其畜產(chǎn)品生產(chǎn)供應(yīng)。OIE在1984年將口蹄疫列為A類傳染病之首［1］。FMDV分為A、O、C、SAT I、SAT II、SAT及Asia 1七個血清型，每個型分為若干個亞型，型及亞型間幾乎無交叉免疫反應(yīng)。FMDV衣殼含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1蛋白暴露于病毒顆粒表面，能誘導(dǎo)感染動物產(chǎn)生中和抗體，在分子流行病學(xué)調(diào)查、毒株型與亞型分析、基因工程疫苗研制等方面具有較重要學(xué)術(shù)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義［2］。目前，口蹄疫防治主要依靠疫苗免疫，我國對口蹄疫施行強(qiáng)制性免疫?？焖佟?zhǔn)確的診斷是控制口蹄疫疫情蔓延和追蹤疫源的重要環(huán)節(jié)。由于口蹄疫病毒近些年流行毒的突變發(fā)生頻率越來越高，而市售口蹄疫抗體檢測試劑盒僅能涵蓋較少毒株，因而已經(jīng)不能滿足對現(xiàn)有毒株的檢出能力，為了克服這一缺陷，本試驗(yàn)針對國內(nèi)5種口蹄疫流行毒株（OS/99、OZK/93、O/HB、O/XJ/10-11和O/GX/09-7），采用生物信息學(xué)方法對這5種毒株VP1結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行精確分析［3］，篩選出5條肽，用全自動多肽合成儀（PSI500）進(jìn)行合成［4］，制備出更新更全的包被抗原，建立了豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法，為進(jìn)一步研發(fā)豬口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1包被抗原分別為來自O(shè)S/99、OZK/93、O/ HB、O/XJ/10-11和O/GX/09-7毒株VP1結(jié)構(gòu)蛋白的表位（位于氨基酸140～160區(qū)域），由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院合成并純化。

1.1.2主要試劑兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗，購自Sigma公司；其他試劑，購自Amresco公司；豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥公司（UBI）；口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.1.3血清豬口蹄疫O型陰、陽性對照血清 本公司制備；100份豬口蹄疫O型病毒感染豬血清，100份豬口蹄疫O型疫苗免疫血清，100份健康豬血清（口蹄疫抗體為陰性），280份豬臨床血清由蘭州生物藥廠提供；豬瘟陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬水皰病陽性血清、豬口蹄疫A型陽性血清，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性血清，成都生物藥廠提供。

1.2方法

1.2.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采取方陣滴定方法，用包被液將合成肽包被抗原分別作8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625（μg/ml/肽）倍比稀釋；將陽、陰性血清從1∶10、1∶20稀釋至1∶320，比較P/N值（P：陽性對照孔OD450值；N：陰性對照孔OD450值），以P/N值最大的孔所對應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.2.2最佳封閉條件的確定分別用含0.2%、0.5%和1%BSA的0.01%Tween-20 PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）作為封閉液，進(jìn)行ELISA檢測，比較P/N值，以P/N值最大孔對應(yīng)封閉液配方作為最佳封閉液。

1.2.3底物反應(yīng)時(shí)間的確定分別置37℃孵育10、15 min及20 min，進(jìn)行ELISA檢測，比較P/N值，以確定底物最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4臨界值的確定對100份健康豬血清進(jìn)行測定，根據(jù)健康動物血清樣本ELISA測定OD450平均值（X）加上3個標(biāo)準(zhǔn)差（SD）得出試劑盒臨界值。

1.2.5敏感性試驗(yàn)對100份感染豬血清和100份免疫血清進(jìn)行檢測。

1.2.6特異性試驗(yàn)對100份健康豬血清、豬瘟、豬水皰病、豬圓環(huán)病毒病、豬PRRS、豬口蹄疫A型陽性血清各2份分別進(jìn)行檢測。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)用同一批次包被酶標(biāo)反應(yīng)板和相應(yīng)試劑，分別檢測已知背景15份血清樣本，其中陰性、強(qiáng)陽性和弱陽性血清各5份，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。用3批包被酶標(biāo)反應(yīng)板和相應(yīng)試劑，分別檢測已知背景15份血清樣本，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.2.8與其他試劑盒比對試驗(yàn)對280份臨床血清用本方法、UBI試劑盒和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所試劑盒進(jìn)行比對試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

結(jié)果顯示（表1），當(dāng)抗原包被濃度為0.5 μg/mL/肽，血清稀釋度為1∶20時(shí)，P/N值最大。從而確定抗原最佳包被濃度為0.5 μg/mL/肽，血清最佳稀釋度為1∶20。

表1　方陣滴定結(jié)果　（P/N比值）

2.2最佳封閉條件的確定結(jié)果顯示（圖1），含有1%BSA、0.01%Tween-20的PBS封閉效果最好。

2.3底物反應(yīng)時(shí)間的確定結(jié)果顯示（圖2），加入底物液反應(yīng)15 min后，P/N值最高。

2.4臨界值的確定所測得100份健康豬血清平均OD450值（X）為0.143，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）值為0.036，X+3SD=0.254?！?.254判為陽性；＜0.254判為陰性。

2.5敏感性試驗(yàn)本方法對100份感染豬血清和100份免疫血清進(jìn)行檢測（見表2），其中192份血清為陽性，8份血清為陰性，敏感性為96.0%。

圖1　封閉液的確定

圖2　底物反應(yīng)時(shí)間的確定

2.6特異性試驗(yàn)本方法對100份健康豬血清檢測僅有1份為陽性，其他病原陽性血清均為陰性（表2），特異性為99.1%（109/110）。

表2　試劑盒敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.7重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在3.0%～9.7%之間。批間重復(fù)性結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)在1.5%～7.2%之間，表明該試劑盒重復(fù)性較好。

2.8與其他試劑盒比對試驗(yàn)對280份臨床血清進(jìn)行檢測，本檢測方法陽性率為44.6%。UBI試劑盒檢出陽性率為42.9%。兩者共有261份血清檢測結(jié)果一致，因而符合率為93.2%。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所試劑盒檢測陽性率為47.5%。兩者總共有240份血清檢測結(jié)果一致，因而符合率為85.7%。

表3　試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4　與其他試劑盒比對試驗(yàn)

3　討論

目前FMD診斷方法主要包括臨床診斷、病毒分離、血清學(xué)及分子生物學(xué)診斷技術(shù)。本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測方法采用生物信息學(xué)方法針對國內(nèi)流行的口蹄疫病毒O型流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行精確分析，從5個代表毒株主要抗原表位上篩選出合適的5條肽段，制備更新更全的包被抗原。將合成肽做為包被抗原，有很多優(yōu)越性，首先，合成肽是化學(xué)合成的，生產(chǎn)過程中無需接觸和使用病毒，無生物安全隱患，不含雜蛋白。其次，合成肽是FMDV外殼表面蛋白質(zhì)VP1特定抗原決定簇序列，與相應(yīng)抗體的結(jié)合力強(qiáng)，從而決定了本檢測方法檢測的敏感性。此外合成肽是短肽，這種短肽的特定區(qū)域不具有對其他非特異性抗體的交叉反應(yīng)性［5］，因此該試劑盒在高效、特異、快捷及生物安全性上實(shí)現(xiàn)了較完美的結(jié)合。該試劑盒敏感性為96.0%，特異性為99.1%，重復(fù)性好，與UBI公司的豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA診斷試劑盒符合率為93.2%，與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒符合率為85.7%，符合市場要求。

［1］Kitching R P.Foot-and-mouth disease：currentworld situation［J］. Vaccine，1999，17（13-14）：1772-1774.

［2］Acharya R，F(xiàn)ry E，Stuart D，et al.The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution［J］.Nature，1989，337（6209）：709-716.

［3］Krebs O，Berger H G，Marquardt O.The capsid protein-coding sequence of foot-and-mouth disease virus O Brescia［J］.Arch Virol，1991，120：135-143.

［4］Baxt B，Becker Y.The effect of peptides containing the arginine glycine aspartic acid sequence on the adsorption of foot-andmouth disease virus to tissue culture cells［J］.Virus Genes，1990，4：73-83.

［5］Wang C Y，Chang T Y，Walfield A M，et al.Effective syntheticpeptide vaccine for foot and mouth disease in swine［J］.Vaccine，2002，2603-2610.

Development of an ELISA based on synthetic peptidefor detection of porcinefoot-and-mouth diseasevirus VP1 antibody infection by O serotype

DONG Chun-na1，XIAO Jin1，2，ZHANG Lei1，BA Li-min1，LI Li-fang1，SONG Fang1，QI Peng1
（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd.Ministry of Agriculture Key Laboratory of veterinary biologics and drugs；Veterinary peptide vaccine design and preparation of engineering and technology center of Beijing，Beijing 100070，China；college of veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100093，China）

Five specific peptides of FMDV VP1 were synthesized by a solid-phase method and used to detect antibody of FMDV serotype O.The ELISA reaction system was optimized and the sensitivity，specificity and repeatability were tested.The result showed that the sensitivity and specificity of this method were 96.0%and 99.1%，and variations of intra-assay and inter-assay repeatability test of the method were below 10.0%.Comparing this assay with UBI VP1 ELISA kits and the liquid phase blocking ELISA kits by detecting 280 samples，we showed that the agreement was 93.2%and 85.7%，respectively.This assay has high sensitivity and specificity，and is also stable and convenient，which can be used to monitor the antibody level of FMDV serotype O.

FMDV；synthetic peptide；antibody；ELISA

QI Peng

S854.43

A

0529-6005（2016）04-0039-03

2014-10-20

“十二五”863項(xiàng)目?？谔阋吆铣呻囊呙缪兄疲?011-AA10A211）

董春娜（1973-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物免疫學(xué)，E-mail：dongchunna@126.com

肖進(jìn)（1978-），男，工程師，博士生，主要從事合成肽疫苗及診斷試劑研發(fā)工作，E-mail：13611015197@126.com

注：肖進(jìn)與董春娜對本文具有同等貢獻(xiàn)

齊鵬，E-mail：cahic_ivd@vip.tom.com