雞小腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及NLRP3在該細(xì)胞中的表達(dá)

陶志云，朱春紅，徐文娟，姬改革，李慧芳

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125）

雞小腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及NLRP3在該細(xì)胞中的表達(dá)

陶志云，朱春紅，徐文娟，姬改革，李慧芳

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125）

為了探明NLRP3在雞小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)情況，為雞的NLRP3基因在小腸細(xì)胞中的功能研究奠定基礎(chǔ)。采用18胚齡的雞胚，分離培養(yǎng)雞的小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）；采用免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）和反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，檢測(cè)NLRP3基因在雞小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明：分離培養(yǎng)出活性較強(qiáng)的IEC；ICC檢測(cè)顯示獲得的小腸上皮細(xì)胞表面NLRP3抗原陽(yáng)性，RT-PCR法可擴(kuò)增出520 bp的目的片段。表明成功分離培養(yǎng)出雞小腸上皮細(xì)胞，并證明雞NLRP3在雞小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)。

雞；小腸上皮細(xì)胞；NLRP3

NLRP3是近年發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)型模式識(shí)別受體—NOD樣受體家族的一員，研究表明，其能識(shí)別多種微生物，在機(jī)體固有免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生中具有重要作用。NLRP3炎性小體與多種感染性和免疫性疾病相關(guān)。近年研究表明，NLRP3在炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮重要作用［1-3］。但這些研究對(duì)象都是哺乳動(dòng)物，未見(jiàn)在禽類中的研究報(bào)道。雞NLRP3基因能否識(shí)別雞腸道微生物，發(fā)揮抗病作用尚不知曉。研究表明，NLRP3在嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞中均有表達(dá)［4］。但是否在雞小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)尚不清楚。因此，本文分離培養(yǎng)了雞小腸上皮細(xì)胞，并鑒定NLRP3在小腸細(xì)胞中的表達(dá)情況，為NLRP3在禽類的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)選擇18胚齡的雞胚，雞胚來(lái)源于國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)（江蘇）。

1.2主要試劑和儀器DMEM（Coning），DMEM/ F12（Hyclone），胰蛋白酶（Amresco），I型膠原酶（Solarbio），胎牛血清（Hyclone），CK18兔多克隆抗體（BBI），NLRP3兔多克隆抗體（BBI），猴抗兔二抗（BBI），TRNzol-A+總RNA提取試劑（Tiangen）、SYBR Green SuperReal PreMix（Tiangen）、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（Tiangen）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Memmert），生物安全柜（蘇凈安泰）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；酶標(biāo)儀（Rayto），PCR儀（Eppendorf）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1雞小腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)孵化至18胚齡的雞胚去殼，用無(wú)菌鑷子挑出胚胎，置于加入青、鏈霉素的PBS的燒杯中。在生物安全柜中，于無(wú)菌培養(yǎng)皿中小心剝離小腸，去除腸系膜，用PBS將小腸內(nèi)腔沖洗干凈，剪碎成1 mm3碎片，用DMEM重懸，按1∶1的比例加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶消化30～40 min，加入適量FBS終止消化，反復(fù)吹打多次，然后將消化液先用50目尼龍濾膜過(guò)濾，收集濾液去除未消化完全的組織，再用300目的尼龍膜過(guò)濾去除單細(xì)胞，收集尼龍膜上的小腸隱窩細(xì)胞團(tuán)于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)液中，調(diào)整適當(dāng)密度接種于6孔培養(yǎng)板或96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2雞小腸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征。

1.3.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的活性和生長(zhǎng)。將小腸隱窩細(xì)胞團(tuán)按1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別在培養(yǎng)的1 d到10 d用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞在492 nm處的光吸收值（OD）值，每天設(shè)10個(gè)復(fù)孔。

1.3.4免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定小腸上皮細(xì)胞和檢測(cè)NLRP3的表達(dá)本試驗(yàn)針對(duì)上皮組織的特異性抗原成分即細(xì)胞角蛋白（CK18）進(jìn)行小腸上皮細(xì)胞的鑒定。在細(xì)胞培養(yǎng)至6 d時(shí)，PBS洗2～3遍；用4%多聚甲醛室溫下固定30 min；0.5%Triton-X100通透處理15 min，PBS洗2～3次；5%BSA封閉20 min；添加適當(dāng)1抗（1∶50），室溫1～2 h，PBS洗 2～3次；陰性對(duì)照添加等量PBS；加入生物素化猴抗兔IgG，室溫1 h，PBS洗2～3次；熒光顯微鏡下觀察。NLRP3在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)方法同CK18鑒定小腸上皮細(xì)胞。

1.3.5RT-PCR法檢測(cè)NLRP3的表達(dá)取小腸上皮細(xì)胞的總RNA，反逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Gen-Bank中的雞NLRP3序列（KJ470775.1），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5′-CGGCATCTGGAAGCACAAGG-3′；下游引物序列為5′-GAAACTGCCCAACACGCTCT-3′。目的片段長(zhǎng)度520 bp，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，退火溫度60℃，72℃延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1雞小腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生長(zhǎng)情況

由圖1不同時(shí)間的小腸上皮細(xì)胞圖1和圖2的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖可見(jiàn)，兩者結(jié)果一致，即分離培養(yǎng)的小腸隱窩細(xì)胞團(tuán)在24 h開(kāi)始生長(zhǎng)，即貼壁并在周圍輻射出少量的小腸上皮細(xì)胞，為多角形或蝌蚪形，在4～6 d，細(xì)胞快速增殖，分裂旺盛，分布均勻，數(shù)量顯著增多，形成集落，呈單層“鋪路石”狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)7～8 d，細(xì)胞分裂開(kāi)始減少，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。培養(yǎng)9 d以后，細(xì)胞體積發(fā)生膨大，細(xì)胞量出現(xiàn)減少。

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定雞小腸上皮細(xì)胞本文采用上皮組織的特異性抗原成分細(xì)胞角蛋白CK18的特異性抗體-兔CK18多克隆抗體，對(duì)小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，再用FITC標(biāo)記的抗兔二抗與之結(jié)合，陽(yáng)性細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯綠色熒光（圖3，A2）。對(duì)照組未加CK18抗體，因此熒光顯微鏡下未見(jiàn)熒光（圖3，A1）。

圖1　培養(yǎng)不同時(shí)間的小腸上皮細(xì)胞

圖2　雞小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3雞小腸上皮細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)鑒定采用兔的NLRP3多克隆一抗和帶FITC熒光標(biāo)記的二抗對(duì)雞小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色后，可見(jiàn)明顯的綠色熒光（圖4A），陰性對(duì)照組無(wú)綠色熒光（圖4B）。采用反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)NLRP3基因在雞小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，獲得條帶單一、明亮的目的片段，經(jīng)測(cè)序?yàn)?20 bp，陰性對(duì)照管未加cDNA模板，未見(jiàn)目的條帶（圖5）。

圖3　CK18雞小腸上皮細(xì)胞鑒定

圖4　NLRP3在小腸上皮細(xì)胞中的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

圖5　雞NLRP3基因的部分cDNA片段凝膠電泳

3　討論

3.1雞小腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)不同的消化液對(duì)小腸上皮細(xì)胞分離效果不同，已有研究表明，采用膠原酶I消化可獲得大量細(xì)胞團(tuán)［5-6］。本試驗(yàn)采用18日齡的雞胚，0.1%I型膠原酶消化30～40 min，在消化過(guò)程中用吸管輕輕的反復(fù)吹打組織塊以利于細(xì)胞分離，也獲得了大量腸隱窩細(xì)胞團(tuán)，分離效果較好。酶消化后的細(xì)胞懸液中混有大量的單個(gè)細(xì)胞，需要進(jìn)一步進(jìn)行純化處理。小腸隱窩細(xì)胞團(tuán)的純化方法很多，包括機(jī)械刮除法、相差消化-相差貼壁法等［7］。這兩種方法均可以獲得較純的小腸上皮細(xì)胞，但比較費(fèi)時(shí)和費(fèi)力。Grossmann等（2003）報(bào)道了一種快速純化IEC的方法［8］。本文在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，經(jīng)鑒定獲得了純度較高的小腸上皮細(xì)胞。對(duì)分離、純化的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后的形態(tài)觀察和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制，結(jié)果表明，細(xì)胞在1～2 d為貼壁和緩慢生長(zhǎng)期，3 d后生長(zhǎng)加速并進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，8 d后由于細(xì)胞密度較高彼此擠壓生長(zhǎng)受到抑制，增殖下降。

3.2NLRP3在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)研究表明，小腸上皮細(xì)胞感染腸炎耶爾森病原體過(guò)程中，NLRP3炎性小體激活［9］，表明NLRP3在識(shí)別病原菌過(guò)程中具有重要作用。我們之前的研究報(bào)道了NLRP3基因在雞不同組織中的表達(dá)情況［10］，表明NLRP3在小腸中有表達(dá)，但其在腸道識(shí)別病原菌和腸道疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚不清楚。因此，體外分離培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞并研究NLRP3在小腸上皮細(xì)胞中的功能具有重要意義。本試驗(yàn)在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平鑒定了NLRP3在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，這為以后NLRP3在雞小腸上皮細(xì)胞中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and cultureof chicken intestinal epithelial cells and theexpression of NLRP3 in thesecells

TAO Zhi-yun，ZHU Chun-hong，XU Wen-juan，JI Gai-ge，LI Hui-fang
（Jiangsu Institute of Poultry Sciences，Yangzhou 225125，China）

The aim of this study is to ascertain the expression of NLRP3 in intestinal epithelial cells（IECs）of chicken，and lay the foundation for the functional studies of chicken NLRP3 gene in IECs.Intestinal epithelial cells were isolated and cultured from chicken embryo at 18 days.The expression of chicken NLRP3 was detected by immunocytochemistry（ICC）and reverse transcription PCR（RT-PCR）method.The results showed that chicken IEC grew very well.The surface antigen of NLRP3 was positive by ICC，and the 520 bp fragments of NLRP3 gene was obtained by RT-PCR length.Chicken IECs were isolated and cultured successfully.These results indicate that chicken NLRP3 gene exists in chicken IECs.

chicken；intestinal epithelial cells；NLRP3

LI Hui-fang

S858.31

A

0529-6005（2016）04-0022-03

2014-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31101795，3110 1833）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域863計(jì)劃（2011AA100301）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-42-G03）

陶志云（1979-），女，助理研究員，博士生，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及動(dòng)物遺傳育種方面的研究，E-mail：zhiyun2@126. com

李慧芳，E-mail：lhfxf-002@aliyun.com.cn