基于SELDI-TOF-MS技術(shù)的奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

舒　適，夏　成，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王　剛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

基于SELDI-TOF-MS技術(shù)的奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

舒適，夏成，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王剛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

奶牛乳熱是圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)代謝性疾病，對于奶牛乳熱在病理方面少有血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。本研究目的是探究奶牛乳熱在蛋白質(zhì)組學(xué)層面的變化。試驗21頭患有奶牛乳熱的奶牛和59頭健康奶牛作為試驗動物。試驗通過SELDI-TOF-MS技術(shù)檢驗得到24個差異肽段的峰值，其中10個肽段經(jīng)過Swissport Protein數(shù)據(jù)庫搜索鑒定為10種差異蛋白。結(jié)果相對于對照組，乳熱組中表達上調(diào)的蛋白4個；表達下調(diào)的蛋白2個；還有既表達上調(diào)又表達下調(diào)的蛋白4個。結(jié)論本次試驗應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)鑒定了幾個在奶牛發(fā)生乳熱時表達的差異蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)也為以后揭示奶牛乳熱代謝性改變提供了依據(jù)。

SELDI-TOF-MS技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)；乳熱；奶牛

奶牛乳熱是高產(chǎn)奶牛常發(fā)的一種代謝性疾病。乳熱能引起患病奶牛發(fā)生某些重要的疾病，如乳腺炎，酮病，胎衣不下，真胃變位以及子宮脫出等。奶牛乳熱以低鈣血癥為特征，當(dāng)奶牛血鈣濃度降低時，機體將通過增加甲狀旁腺素分泌和1，25二羥維生素D3生成來調(diào)控血鈣水平［1］。

表面增強激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（SELDITOF-MS）是一種新發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。與傳統(tǒng)的熒光雙向凝膠電泳相比，SELDI-TOF-MS可以應(yīng)用不同的色譜層析表面來運送蛋白點，并且具有操作簡便、耗時短、尋找差異蛋白廣泛的優(yōu)點［2］。近年來，SELDI-TOF-MS技術(shù)廣泛應(yīng)用于乳腺癌、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征以及藥物發(fā)現(xiàn)的研究。

有關(guān)奶牛乳熱發(fā)生的病因?qū)W涉及生理、生化、病理等多方面應(yīng)用SELDI蛋白芯片的方法探索該病的研究少有報道。本研究目的在于應(yīng)用SELDI技術(shù)進一步從蛋白組學(xué)角度探索奶牛乳熱發(fā)生時機體可能出現(xiàn)功能變化。

1　材料與方法

1.1試驗動物在黑龍江某集約化養(yǎng)牛場選取荷斯坦奶牛80頭作為試驗動物，根據(jù)其血鈣濃度和臨床表現(xiàn)將其分為乳熱組（T，Ca＜1.50 mmol/L和明顯臨床癥狀）和健康對照組（C，Ca＞2.20 mmol/L和無臨床癥狀）（表1）。

表1　試驗?zāi)膛５哪挲g、胎次和血鈣平均水平（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

1.2血漿檢測在患病和正常奶牛分娩當(dāng)天6 h內(nèi)，尾靜脈采血10 mL。肝素抗凝，迅速離心（3 000 r/min離心5 min）分離血漿，置于-80℃冰箱冷凍保存。應(yīng)用全自動生化分析儀（modullarDPP，德國羅氏），血漿鈣試劑盒（651564-01，德國羅氏）檢測。

1.3SELDI-TOF-MS試驗

1.3.1樣品處理-80℃冰箱中取出血清樣品冰盒上融解，10 000 r/min（4℃）離心5 min；每個芯片點需要奶牛血清10 μL，將血清用1倍體積U9緩沖液稀釋，冰浴振蕩30 min；將20 μL樣品加入180 μL相應(yīng)的CM10結(jié)合緩沖液，混勻后上樣到芯片上。

1.3.2芯片處理芯片每孔加入10 Mm HCl 5 μL放入濕盒中清洗5 min，洗滌后棄去液體加入5 μL HPLC級超純水震搖洗滌5 min；CM10蛋白芯片每孔加入100 μL洗脫緩沖液室溫劇搖孵育5 min；棄去洗脫緩沖液加入100 μL樣品，劇搖孵育60 min。棄去樣品加入100 μL洗脫緩沖液室溫劇搖孵育5 min后棄去洗脫緩沖液，每孔加入100 μL HPLC級超純水震搖洗滌5 min；棄去水溶液，將芯片取出干燥10～15 min，SELDI上分析蛋白芯片。

2　結(jié)果

2.1SELDI-TOF-MS檢測結(jié)果以及預(yù)測蛋白通過Ciphergen ProteinChip軟件對在兩組差異峰圖進行分析。將兩組之間的數(shù)據(jù)峰值做Wilcoxon統(tǒng)計檢驗。篩選出P值小于0.01的差異峰，并獲得了37個差異峰。并選取預(yù)測蛋白結(jié)果中差異最顯著的點，即m/z為3898.65點，通過Trace view和Gel view分別展示（見中插彩版圖1）。

在得到的37個差異峰中，經(jīng)Swissport蛋白數(shù)據(jù)庫檢索蛋白作為差異峰可能的蛋白預(yù)測結(jié)果。獲得24個可預(yù)測的差異峰（P＜0.01），預(yù)測蛋白10種。相對于C組，在T組中有4個蛋白表達上調(diào)（補體蛋白c3，淀粉樣蛋白βA4蛋白，血清蛋白，海帕西啶），2個蛋白表達下調(diào)（血漿蛋白酶c1抑制劑，載脂蛋白A2）和4個蛋白既表達上調(diào)又表達下調(diào)（纖維蛋白原α鏈，VGF，血清淀粉樣蛋白α，胱抑素c）。

2.2生物信息學(xué)分析應(yīng)用Cytoscape軟件對實驗結(jié)果的10種蛋白進行牛類基因網(wǎng)絡(luò)搜索，并得到Networks分析結(jié)果圖，數(shù)據(jù)庫來源于網(wǎng)絡(luò)軟件STRING。根據(jù)搜索結(jié)果，本試驗有6種蛋白質(zhì)可在數(shù)據(jù)庫中搜索得到結(jié)果，分別是HAMP，SAA1，ALB，C3，CST3和APP。并得到其相關(guān)的Networks分析結(jié)果，見中插彩版圖2。

3　討論

本試驗在T組獲得了4個表達上調(diào)的蛋白，2個表達下調(diào)的蛋白，以及4個既表達上調(diào)，又表達下調(diào)的蛋白。

首先，4個表達上調(diào)的蛋白分別是complement c3 frag、amyloid beta a4 protein、serum albumin frag、hepcidin。當(dāng)奶牛發(fā)生乳熱時，免疫細(xì)胞對刺激的敏感性降低，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。本試驗結(jié)果顯示，由炎癥活化巨噬細(xì)胞分泌的一種在免疫系統(tǒng)中具有中心作用的C3補體片段和能夠通過鐵加載和激活炎癥反應(yīng)的海帕西啶［3］均在乳熱組表達上調(diào)，提示在乳熱發(fā)生過程中，補體系統(tǒng)發(fā)揮作用以提高機體免疫防御功能，但是否與海帕西啶有關(guān)尚不知曉。另外，β淀粉樣蛋白表達上調(diào)產(chǎn)生神經(jīng)毒素而導(dǎo)致老年癡呆癥，乳熱奶牛時常表現(xiàn)精神沉郁和癱瘓等癥狀，是否與它有關(guān)需要進一步證實。雖然血清白蛋白與奶牛乳熱發(fā)生的關(guān)系未見報道，但本試驗的結(jié)果對兩者關(guān)系研究提供了實驗依據(jù)。

其次，2個表達下調(diào)的蛋白：plasma protease c1 inhibitor frag、apolipoprotein a-2。C1抑制劑作為炎癥反應(yīng)重要的抑制劑［4］，在乳熱奶牛炎性疾病發(fā)生時，其表達下調(diào)，表明未發(fā)揮其抑制炎癥的作用。近期的研究表明，載脂蛋白（ApoA-II）與心血管疾病有關(guān)，它可以運載一些蛋白來抵抗這種疾病。當(dāng)ApoA-II表達下調(diào)時，可引發(fā)心血管疾病，提示可能與奶牛發(fā)生乳熱時出現(xiàn)心動過速，心律不齊有關(guān)。C1抑制劑和ApoA-II與乳熱奶牛的關(guān)系也需要進一步驗證。

此外，4個即表達上調(diào)，又表達下調(diào)的蛋白。

纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白是凝血過程中一個重要的過程［5］，而Ca2+在這個過程中起到促進作用。纖維蛋白原表達上調(diào)可能與奶牛乳熱繼發(fā)的炎癥反應(yīng)相關(guān)；而纖維蛋白原表達下調(diào)則可能與血液凝固通路有關(guān)，纖維蛋白原大部分轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，同時消耗大量的Ca2+，可能是血漿鈣濃度降低的一個因素。這也與之前C1抑制劑促進凝血的觀點相一致。

當(dāng)機體發(fā)生神經(jīng)受損、炎癥反應(yīng)時，VGF會表達上調(diào)［6］。而當(dāng)機體發(fā)生老年癡呆癥都會引起VGF的下調(diào)［7］。與上述結(jié)論相同，VGF的表達上調(diào)可能與乳熱奶牛的炎癥反應(yīng)相關(guān)；而VGF表達下調(diào)則與β淀粉樣蛋白表達上調(diào)引起老年癡呆癥，可能與奶牛表現(xiàn)精神沉郁有關(guān)，但是仍需要進一步研究。

SAA可增加HDL分解代謝，降低血清膽固醇脂化、改變HDL分布［8］。SAA表達上調(diào)可能與奶牛發(fā)生乳熱后，機體繼發(fā)感染的時間有關(guān)；而SAA表達下調(diào)可使HDL分解代謝降低，這也與上述Apo-AII表達下調(diào)的結(jié)果相一致。

奶牛乳熱發(fā)生時，機體免疫力下降，這可能與胱抑素C表達上調(diào)使免疫應(yīng)答受阻相關(guān)；血漿鈣濃度降低是奶牛乳熱的一個重要標(biāo)志指標(biāo)，而當(dāng)血漿鈣濃度降低時，正常機體會使腎臟對Ca2+的重吸收增加，以恢復(fù)血漿鈣濃度，而患病時，胱抑素C表達下調(diào)直接反映腎小球濾過率降低［9］，這可能與腎臟對Ca2+重吸收未發(fā)揮作用有關(guān)。

這4種蛋白質(zhì)在本試驗中既表達上調(diào)又表達下調(diào)，可能與蛋白質(zhì)本身參與的生理病理過程有關(guān)，奶牛發(fā)生乳熱時引起這些蛋白上、下調(diào)的同時變化的現(xiàn)象，值得進一步探究。

總之，本試驗首次應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)研究奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)，成功預(yù)測了10種蛋白質(zhì)并發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了改變，這可能與奶牛乳熱發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，這為今后深入研究這10種蛋白與奶牛乳熱發(fā)生的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Plasma Proteomics Analysis of Dairy Cows with Milk Fever Using SELDI-TOF-MS

SHU Shi，XIA Cheng，ZHANG Hong-you，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIAO Xin-huan，WANG Gang
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Milk fever is an important metabolic disorder of dairy cows at calving.There have been many studies on the pathophysiology of milk fever，but the plasma proteomics of milk fever has not been reported.The aim of this study was to investigate novel changes in the plasma proteomics of cows with milk fever.Plasma samples were obtained from 21 Holstein cows with milk fever（T），and 59 control Holstein cows without milk fever（C）.24 differential peptide peaks in the plasma of T and C cows were isolated by SELDI-TOF-MS.10 of these peaks were identified by Swissport Protein Database.The petide peaks represented 10 unique proteins，and had significant alterations in peaks as determined.The up-regulated proteins were 4，and the down-regulated proteins were 2.The other proteins which were up-regulated as well as down-regulated were 4.In conclusion，we were able to use SELDI-TOF-MS to identify several novel plasma proteins in cows with milk fever.These findings may reveal new metabolitechanges in cows with milk fever.

SELDI-TOF-MS；plasma proteomics；milk fever；dairy cows

XIA Cheng

S858.23

A

0529-6005（2016）04-0016-03

2014-11-21

國家自然科學(xué)基金項目主任基金（30840060）；國家自然科學(xué)基金面上項目（30972235）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目（C200916）

舒適（1986-），女，博士生，研究方向為臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)動物營養(yǎng)代謝病，E-mail：519296311@qq.com

夏成，E-mail：xcwlxyf@sohu.com