絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌絲體形態(tài)控制研究進(jìn)展

蔣雪薇 李 浩 楊 琛 許延濤 羅曉明

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院, 湖南 長沙 410114)

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絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌絲體形態(tài)控制研究進(jìn)展

蔣雪薇 李 浩 楊 琛 許延濤 羅曉明

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院, 湖南 長沙 410114)

絲狀真菌廣泛用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，其菌絲體形態(tài)與發(fā)酵液粘度、目的產(chǎn)物產(chǎn)量有著密切關(guān)系，是發(fā)酵過程控制的關(guān)鍵因素之一。文章綜述了絲狀真菌液體深層發(fā)酵中菌絲體的形態(tài)特征及其分析與表征方法、菌絲球形成機(jī)理及菌絲體形態(tài)控制對(duì)發(fā)酵影響的研究進(jìn)展，指出量化描述絲狀真菌的生長是精確控制發(fā)酵過程的基礎(chǔ)。

絲狀真菌；液體深層發(fā)酵；菌絲體形態(tài)控制

絲狀真菌在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)以及環(huán)保等發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用十分廣泛，是工業(yè)大宗發(fā)酵產(chǎn)品的主要貢獻(xiàn)者之一，其可以生產(chǎn)許多具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的代謝產(chǎn)物，如抗生素、有機(jī)酸、酶制劑等，具有巨大的工業(yè)和社會(huì)價(jià)值[1-2]。絲狀真菌在液體深層發(fā)酵中，菌絲體形態(tài)特征及菌絲體生理特性是重要參數(shù)，這些參數(shù)的變化會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的積累產(chǎn)生較大的影響，其中菌絲體形態(tài)的變化主要是通過影響發(fā)酵液粘度為主的流變學(xué)參數(shù)來影響發(fā)酵產(chǎn)物的積累[3]。發(fā)酵液流變學(xué)特性的變化會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中傳質(zhì)效果變化，致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、氧等底物的吸收及產(chǎn)物的生成發(fā)生變化，從而導(dǎo)致代謝途徑發(fā)生改變，甚至產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，最終影響到目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率[4-5]。另外，菌絲體的形態(tài)還會(huì)對(duì)下游提取工藝產(chǎn)生影響，從而影響到產(chǎn)物提取收率[6-7]?？梢哉f，絲狀真菌液體深層發(fā)酵中，菌絲體形態(tài)控制是目標(biāo)產(chǎn)物收獲量控制的關(guān)鍵之一[8-9]。

1 絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌絲體的形態(tài)特征及菌絲球形成機(jī)理

1.1 形態(tài)特征

搖瓶發(fā)酵中，由于絲狀真菌的生長條件受到人為調(diào)控，其菌絲體形態(tài)會(huì)隨培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等的不同而出現(xiàn)不同形態(tài)，可能出現(xiàn)無分支的菌絲、有分支且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的菌絲、菌絲團(tuán)塊、菌絲球等形態(tài)，表現(xiàn)出不同大小、密度及表面結(jié)構(gòu)[10-11]；此外，隨時(shí)間變化，不同生長時(shí)期的菌絲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變。因此，絲狀真菌在液體深層發(fā)酵中菌絲體通常呈現(xiàn)出絮狀、團(tuán)狀和球狀3種形態(tài)(圖1)[12]。不同的菌絲體形態(tài)其產(chǎn)物也會(huì)產(chǎn)生變化，可以說，絲狀真菌目標(biāo)產(chǎn)物的獲得常常要有有利于產(chǎn)物形成的最佳菌絲體形態(tài)[13]，如分散的菌絲體有利于淀粉酶、糖化酶的產(chǎn)生，而菌絲球則有利于絲狀真菌進(jìn)行深層發(fā)酵產(chǎn)抗生素、有機(jī)酸及酶制劑等[9,14]。

菌絲體形態(tài)對(duì)發(fā)酵液的粘度影響較大。在大多數(shù)發(fā)酵生產(chǎn)中，絲狀真菌菌絲若形成絮狀的菌絲體，會(huì)造成發(fā)酵液粘度增大，不利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的溶解、傳遞及分布，從而降低好氧發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率極低[15]。若菌絲體形態(tài)為過于緊密的團(tuán)塊狀，在團(tuán)塊內(nèi)部，營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣傳遞受阻，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部出現(xiàn)營養(yǎng)匱乏及缺氧狀態(tài)，影響菌絲體生長及產(chǎn)物合成，有時(shí)還會(huì)造成團(tuán)塊內(nèi)部菌絲體發(fā)生自溶現(xiàn)象[16]。液體深層發(fā)酵的孢子萌發(fā)出菌絲及菌絲延長的過程中，在孢子聚集及攪拌等機(jī)械力作用下，發(fā)酵液中的菌絲還可以形成大小適中的菌絲球，此時(shí)發(fā)酵液的傳質(zhì)效果好，菌絲體生長旺盛，目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成效率高?？梢哉f，菌絲體形態(tài)是工業(yè)發(fā)酵中獲得目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量最大化的重要影響因素[17-18]。

圖1 絲狀真菌液體深層發(fā)酵中菌絲體的不同形態(tài)

Figure 1 The different mycelial morphologyof filamentous fungi in submerged fermentation

1.2 菌絲球的形成機(jī)理

絲狀真菌菌絲體在液體深層發(fā)酵中形成不同形態(tài)，既與發(fā)酵環(huán)境作用有關(guān)，也跟菌絲體自身某些生理活動(dòng)有聯(lián)系[19-20]。雖然菌絲球形成的條件有很多，但其成球的類型一般有兩種，即孢子聚集型和菌絲體聚集型[21-22]。Lin等[23]采用PARSIVAL軟件擬合黑曲霉胞子聚集后萌發(fā)成球的兩個(gè)階段，發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌絲成球不僅與孢子聚集有關(guān)，而且還和菌絲生長蔓延關(guān)系密切，而菌絲球又可以分為表面光滑型和粗糙型，這與其所處的環(huán)境是相關(guān)的。Li等[24]研究表明，在攪拌剪切力的作用下菌絲球繼續(xù)生長時(shí)，需經(jīng)受住更強(qiáng)的環(huán)境外力，此時(shí)菌絲球會(huì)變得光滑、致密、酶活降低，這可能是其通過改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)以適應(yīng)環(huán)境條件。綜合而言，菌絲球形成的主要影響因素有孢子聚集、菌絲蔓延速率及程度、機(jī)械攪拌作用等。

2 絲狀真菌菌絲體形態(tài)分析與表征方法

2.1 菌絲體形態(tài)的分析方法

絲狀真菌菌絲體形態(tài)特征最常見的分析方法有直接觀測法、圖像分析法等。直接觀測法是最為原始也最為基本的形態(tài)分析研究手段，分為肉眼觀察與顯微鏡觀測兩種，顯微鏡觀測是研究微生物微觀形貌特征最常用的方式。這些傳統(tǒng)的分析觀測手段更多的是憑直觀、憑經(jīng)驗(yàn)，得到的觀測數(shù)據(jù)不僅少，其準(zhǔn)確性也有待提升，不利于形成較為精確的量化數(shù)據(jù)。

圖像分析法是20世紀(jì)80年代引入的一種新的分析方法，其基本步驟有：顯微圖像拍攝、顯微圖像分區(qū)、目標(biāo)定位、檢測與分析等[18]。圖像分析方法最初屬于半自動(dòng)化方法，倘若菌絲擁有不短的分枝長度，則結(jié)果會(huì)更為準(zhǔn)確，但它卻不適合對(duì)菌絲團(tuán)體進(jìn)行觀測分析，并且基本需要人工較為繁瑣的操作[25]。而全自動(dòng)化方法可以測算出菌絲體的大多數(shù)形態(tài)參數(shù)，但還是需要對(duì)菌絲體輪廓進(jìn)行人為的標(biāo)定[26]。由于檢測方法的單一性，難以對(duì)所有菌絲體形態(tài)進(jìn)行很好地測算，菌絲聚集團(tuán)體的分析就更為少見。Reichi等[27]通過圖像分析表征了鏈霉菌屬S.tendae菌絲體在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中菌絲球的大小、含量以及形態(tài)特征；Treskatis等[28]運(yùn)用在線數(shù)字圖像分析和模型識(shí)別系統(tǒng)方法，描述了液體深層發(fā)酵過程中絲狀微生物的形態(tài)特性。

2.2 菌絲體形態(tài)的表征方法

發(fā)酵過程中，絲狀真菌菌絲的生長蔓延是以其尖端生長的形式進(jìn)行的。蔓延后的絲狀真菌形態(tài)各不相同，既有單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，又有多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其生長方式異常復(fù)雜，故菌絲體形態(tài)難以準(zhǔn)確表征。近些年，有學(xué)者[14,29]通過選取不同的參數(shù)，對(duì)不同類型的菌絲體形態(tài)進(jìn)行量化描述，取得了一些進(jìn)展。

隨著顯微圖像分析技術(shù)的進(jìn)步，通過合理選取適當(dāng)?shù)膮?shù)，借助圖像分析軟件對(duì)菌體的特征進(jìn)行測量分析，得到大量的量化數(shù)據(jù)，推動(dòng)了液體深層發(fā)酵中菌絲體形態(tài)學(xué)研究的進(jìn)步。借助圖像分析系統(tǒng)，目前可用于描述菌絲體形態(tài)學(xué)特征的參數(shù)有菌絲長度、菌絲體面積、周長、緊密度、分枝頻率等，其中菌絲球可以選用直徑、長軸、短軸、周長、面積以及面積比等作為量化描述的參數(shù)。已報(bào)道的定量描述絲狀真菌形態(tài)的參數(shù)及量化程度見表1[30-33]。

3 絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌絲體形態(tài)對(duì)發(fā)酵的影響

絲狀真菌可用于許多產(chǎn)物的發(fā)酵法生產(chǎn)中。發(fā)酵過程中由于條件的變化，會(huì)使菌絲體形態(tài)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)傳遞以及溶氧值發(fā)生較大變化，發(fā)酵生產(chǎn)能力也因此發(fā)生較大的差異，故菌絲體形態(tài)變化是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)最值得關(guān)注的因素之一。

3.1 菌絲體形態(tài)對(duì)發(fā)酵液流變學(xué)特性的影響

絲狀真菌的發(fā)酵液中存在大量菌絲體，菌絲體在搖瓶振蕩或發(fā)酵罐中攪拌槳葉的攪拌作用下相互纏繞，會(huì)使發(fā)酵液變得粘稠，影響傳質(zhì)，不利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)[34]。目前，許多絲狀真菌的發(fā)酵過程中均采用菌絲球發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，以降低發(fā)酵液的粘度，L-乳酸生產(chǎn)就是其中之一[35]。根據(jù)顆粒懸浮液理論，菌絲球內(nèi)部都包含有一定體積的流體，稱之為排出體積，其大小對(duì)菌絲球的柔性和結(jié)構(gòu)參數(shù)有較大影響，可以認(rèn)為菌絲球是具有一定柔性的球型顆粒[36-37]。菌絲球這種柔性顆粒的大小直接影響了發(fā)酵液的傳質(zhì)，在發(fā)酵過程中，適宜大小的菌絲球有利于傳質(zhì)，有研究[38]證明，L-乳酸發(fā)酵中菌絲在玉米芯固定化發(fā)酵能形成0.5～5.0 mm的菌絲球，此時(shí)L-乳酸積累最大。這是因?yàn)榫z球所占發(fā)酵液內(nèi)體積比較小，而且呈顆粒狀不會(huì)向四周散漫開，這樣發(fā)酵液的粘度相較于絮狀或團(tuán)塊狀等形態(tài)情況下不會(huì)大幅度提升。一方面，菌絲體自身形態(tài)會(huì)影響發(fā)酵液的流變學(xué)特性，而另一方面，菌絲體各種形態(tài)的形成也是由不同發(fā)酵環(huán)境作用的結(jié)果。除孢子聚集、菌絲蔓延速率及程度、機(jī)械攪拌作用等主要因素影響絲狀真菌菌絲體形態(tài)，從而影響發(fā)酵液流變學(xué)特性外，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的其它各種副產(chǎn)物，也會(huì)對(duì)發(fā)酵液性質(zhì)變化起到作用[39]。

表1 圖像分析中的菌絲體形態(tài)參數(shù)及其量化程度

3.2 菌絲體形態(tài)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物積累的影響

不同的絲狀真菌菌絲體形態(tài)在液體深層發(fā)酵中對(duì)產(chǎn)物的累積會(huì)產(chǎn)生很大的影響。Yu等[40]在氨濃度為0.1 g/L以上的培養(yǎng)基中利用米根霉成絮狀形態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)，pH保持在4.4左右，首批生產(chǎn)乳酸含量達(dá)到109 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)87%。蔣雪薇等[41]在米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中添加表面活性劑吐溫-80使菌絲成球，優(yōu)化發(fā)酵條件后發(fā)現(xiàn)，在吐溫-80用量0.5 g/L、搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度4 g/L時(shí)，菌絲球數(shù)量達(dá)115 mL-1，球體平均直徑為1.2 mm，乳酸產(chǎn)量達(dá)78.9 g/L。趙龍等[38]進(jìn)一步探究了以玉米芯為載體固定米根霉發(fā)酵L-乳酸的工藝條件，結(jié)果表明，玉米芯與葡萄糖質(zhì)量為1∶4時(shí)米根霉形成直徑為0.5～1.0 mm菌絲球，此時(shí)葡萄糖對(duì)L-乳酸的轉(zhuǎn)化率高達(dá)82.5%，其產(chǎn)酸達(dá)到34.68 g/L。Jun Yang等[42]通過海洋真菌Curvulariasp.IFB-Z10的菌絲體形態(tài)的控制來對(duì)其產(chǎn)殺菌生物堿性能進(jìn)行改進(jìn)，在加入200目的滑石粉(5 g/L)后發(fā)現(xiàn)，菌絲球直徑大幅度減少，而目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量增長到33.05 mg/L，為對(duì)照組的1.9倍。這說明，相同菌絲體形態(tài)下不同的形態(tài)參數(shù)如菌絲球大小、菌球密度等對(duì)產(chǎn)物積累影響極大。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，絲狀真菌會(huì)根據(jù)環(huán)境而呈現(xiàn)不同的菌絲體形態(tài)，而這一形態(tài)主要通過影響發(fā)酵液的流變特性來影響產(chǎn)物的合成和提取。菌絲體呈球狀時(shí)發(fā)酵液粘度低，有利于傳質(zhì)，是大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵提高產(chǎn)量的優(yōu)選形態(tài)。然而，目前已有的關(guān)于絲狀真菌菌絲形態(tài)的研究報(bào)道，大多數(shù)只針對(duì)培養(yǎng)基pH與成分、接種孢子、攪拌速率等外在環(huán)境因素對(duì)菌絲球形態(tài)的影響開展研究，對(duì)于菌絲成球深層次上的機(jī)理研究較少。隨著計(jì)算機(jī)及顯微圖像分析技術(shù)的進(jìn)步，借助這些手段，結(jié)合微生物內(nèi)在的生理因素研究，能更科學(xué)地對(duì)絲狀真菌的生長過程進(jìn)行量化描述，實(shí)現(xiàn)液體深層培養(yǎng)環(huán)境中菌絲生長及其形態(tài)的數(shù)學(xué)表達(dá)，為絲狀真菌工業(yè)化生產(chǎn)過程控制提供更多的控制參數(shù)及更為精確的控制方法。

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Progress in research of mycelial morphology control of filamentous fungiin submerged fermentation

JIANG Xue-weiLIHaoYANGChenXUYan-taoLUOXiao-ming

(CollegeofChemistry&Bioengineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China)

Filamentous fungi are widely used in industrial fermentation. Its mycelial morphology is closely combined with objective product yield and fermented liquid viscosity, and it is one of the key factors in the fermentation process control. In this paper, the research progress was reviewed on the mycelia of filamentous fungi in the submerged fermentation,including its morphological characteristics, the analysis and characterization methods, the mechanism of mycelial pellet formation, and the influence of mycelial morphology control in fermentation. Therefore, the author indicated that quantitative description the growth of filamentous fungi was the foundation of precision control on fermentation process.

filamentous fungi; submerged fermentation; mycelial morphology control

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013FJ4036)；清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013A024，2014A023)

蔣雪薇，女，長沙理工大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。

羅曉明(1968—)，男，長沙理工大學(xué)副教授，碩士。

E-mail：csluoxm@sina.com

2016—05—12