家蠶bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage可溶性表達、純化與結(jié)構(gòu)分析

何華偉，位曙光，王葉菁，劉莉娜，李珍珍，趙朋，常懷普，趙萍

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家蠶bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage可溶性表達、純化與結(jié)構(gòu)分析

何華偉1,2，位曙光1，王葉菁1,2，劉莉娜1，李珍珍1，趙朋1，常懷普1,2，趙萍1

1 西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715;2 西南大學生物技術(shù)學院重慶市蠶絲纖維新材料工程技術(shù)研究中心，重慶 400715

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix, bHLH) 轉(zhuǎn)錄因子在生命活動過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bmsage是家蠶絲腺中高量表達的一類bHLH轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與了絲腺細胞在胚胎期的發(fā)育調(diào)控，而且對蠶絲蛋白的合成也有至關(guān)重要的調(diào)控作用，然而當前對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)了解不多。為研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和生物學功能，構(gòu)建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合標簽的Bmsage重組原核表達載體，通過改變誘導溫度和IPTG濃度，確定了Bmsage在大腸桿菌中可溶性表達的最佳載體和表達條件，進而通過鎳柱親和層析純化獲得了Bmsage，利用圓二色光譜研究了其二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，NusA與MBP標簽可顯著增強Bmsage在大腸桿菌中的可溶性表達，但難以與Bmsage分離。SUMO標簽有一定的助溶效果，并且能夠與Bmsage有效分離。其他標簽對Bmsage可溶性表達的效果不明顯。圓二色光譜分析表明Bmsage含有α-helix結(jié)構(gòu)，推測SUMO標簽可能促進了Bmsage折疊形成類天然的結(jié)構(gòu)。這些工作為深入研究Bmsage的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能建立了基礎(chǔ)，同時也為其他類似蛋白的表達純化提供了參考。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋，Bmsage，MBP，NusA，SUMO，純化

生命活動受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix，bHLH) 轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，它們在神經(jīng)元發(fā)生、性別決定、腸組織發(fā)育、肌細胞及血細胞生成[1]等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究者們根據(jù)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子作用的DNA元件和結(jié)構(gòu)特點將其分為6類，同時又根據(jù)其調(diào)控基因的功能將它們分成了45個亞家族[2-4]。

1989年，Murre等在小鼠中首次鑒定了bHLH轉(zhuǎn)錄因子E12和E47[5]。bHLH結(jié)構(gòu)域大約由60個氨基酸殘基組成，包含1個與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域和1個可調(diào)節(jié)蛋白二聚化的HLH結(jié)構(gòu)域[6-7]。1994年，MyoD的bHLH結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)被解析[8]，促進了轉(zhuǎn)錄因子參與DNA識別和轉(zhuǎn)錄激活方面的研究。Imayoshi與Kageyama發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控端腦發(fā)育方面具有多樣化的功能[9]。果蠅唾液腺特異因子sage屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，在果蠅唾液腺的發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。2007年，王勇等以黑腹果蠅bHLH氨基酸序列為查詢模板，從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定到了52個bHLH轉(zhuǎn)錄因子[12]。本實驗室劉春等[13]在家蠶絲腺中鑒定了1個與果蠅sage同源高量表達的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為Bmsage。本實驗室趙小明等在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，Bmsage可以與絲腺因子1 (Silk gland factor-1，SGF-1) 相互作用，調(diào)控絲素重鏈基因的表達[14]。Xin等借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了家蠶基因，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的家蠶絲腺發(fā)育不正 常[15]，但是其具體的調(diào)控機制并不清楚。

盡管Bmsage在家蠶絲腺發(fā)育和蠶絲蛋白的合成方面發(fā)揮著重要的功能，然而，迄今為止，我們對該蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)仍然了解不多。本文希望借助體外重組原核表達技術(shù)，利用溶解性高的多肽序列標簽和Transetta (DE3) 表達菌株，通過改變誘導溫度和IPTG濃度來表達并純化獲得可溶性Bmsage蛋白，從而為研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pET-50b(+)購自Novagen (默克，德國)；pCold-SUMO和pET 32M.3C分別由華南農(nóng)業(yè)大學樊惠英教授和中國科技大學周叢照教授惠贈；ppSUMO、pSKB2和pET-MBP來自美國西南醫(yī)學中心張學武教授的饋贈?？寺【?) DH5α和表達菌株Transetta (DE3) 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶H Ⅰ、d Ⅲ購自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；氨芐青霉素(Amp)、硫酸卡納霉素(Kana)、氯霉素(Cam) 以及異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；常規(guī)蛋白分子量Marker購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學分析

分別利用RACC (http://nihserver.mbi.ucla. edu/RACC/) 和Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)分析基因稀有密碼子及其氨基酸特征。利用IBS 1.0軟件構(gòu)建其基因與蛋白結(jié)構(gòu)模式圖。以Bmsage氨基酸序列為模板，在Pubmed數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) 中進行Blast分析，選取果蠅、蟻、蝶、蚊等種屬中相似的氨基酸序列，利用Clustal X[16]進行序列比對，并利用ESPript[17](http://espript.ibcp.fr/ ESPript/ESPript/index.php) 對bHLH結(jié)構(gòu)域同源比對結(jié)果渲染，借助Mega 6.0[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。根據(jù)5齡3天家蠶各組織芯片基因表達譜(http://www.silkdb.org/microarray/)，借助HemI[19]分析基因表達模式。

1.3 表達載體構(gòu)建

取5齡3 天家蠶后部絲腺組織，利用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，然后以其為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中(ID: BGIBMGA005127) 的CDS序列，利用Primer Premier設(shè)計引物，F(xiàn)orward：5′-CGCATGTACAATCAAACATACGACGAT-3′ (下劃線部分為H Ⅰ酶切位點)；Reverse：5′-CCCTTAGTATCTCTGTTGACGCCTTC-3′ (下劃線部分為d Ⅲ酶切位點)。通過PCR擴增目的基因，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并通過DNA凝膠回收試劑盒對目的DNA片段純化回收。將質(zhì)粒與目的DNA片段利用H Ⅰ和d Ⅲ在37 ℃同時雙酶切4 h，然后利用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆并提取質(zhì)粒，通過雙酶切與基因測序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒進行驗證。

1.4 蛋白可溶性表達條件探索

將測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta (DE3) 細胞，挑取單克隆菌落在37 ℃過夜培養(yǎng)，然后按照1∶100的比例接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至600達到0.5–1.0，加入0.01–1 mmol/L IPTG，在12–37 ℃下誘導表達。160 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h，25 ℃培養(yǎng)10 h，12 ℃、14 ℃和16 ℃培養(yǎng) 20 h，對照為37 ℃下不加IPTG培養(yǎng)4 h的菌液，離心收集細胞。按培養(yǎng)物∶裂解液=10∶1比例加入預(yù)冷的裂解液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L氯化鈉，10%甘油)，充分懸浮細胞。冰浴超聲破碎。菌體裂解物于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE電泳鑒定，比較不同標簽融合蛋白在不同條件下的表達量，篩選較好的表達載體與表達條件。

1.5 目的蛋白純化

根據(jù)篩選的表達載體和表達條件，大規(guī)模培養(yǎng)細菌。細胞破碎后離心收集上清，將上清通過0.45 μm濾膜過濾，在4 ℃下利用鎳柱親和層析對細胞裂解液中的融合蛋白進行分離提純，利用15% SDS-PAGE電泳檢測不同咪唑濃度的洗脫結(jié)果。將純化的融合蛋白通過HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 除去咪唑并同時置換為酶切緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L氯化鈉，5%甘油)，加入蛋白酶在4 ℃酶切16 h。將酶切產(chǎn)物再次通過鎳柱除去融合標簽，從而純化獲得不含標簽的Bmsage。

1.6 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用圓二色光譜儀MOS-500 (Bio-Logic，法國)對Bmsage的二級結(jié)構(gòu)進行分析，蛋白樣品溶于磷酸緩沖液PBS中，波譜掃描范圍為190–250 nm，比色皿光程1 mm，蛋白濃度為 0.1 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學分析

基因位于家蠶第25號染色體，共有4個外顯子和3個內(nèi)含子 (圖1A)，cDNA全長705 bp，編碼234個氨基酸殘基。Bmsage分子量28.1 kDa，等電點5.97，帶電荷氨基酸占整個蛋白的41%。Bmsage中152–205位氨基酸殘基為bHLH結(jié)構(gòu)域 (圖1B)，該區(qū)域等電點為10.1；N末端結(jié)構(gòu)域(1–140) 富含酸性氨基酸殘基，其等電點為4.77。N末端和bHLH結(jié)構(gòu)域之間可能存在電荷-電荷相互作用，從而維持Bmsage構(gòu)象的穩(wěn)定。疏水性分析表明，Bmsage的親水性指數(shù)為–1.223，表明該蛋白趨向于親水。然而，我們發(fā)現(xiàn)，Bmsage容易形成包涵體表達。將Bmsage與可溶性標簽融合表達，融合蛋白雖然以可溶性的形式表達，但是當去除標簽之后，Bmsage容易發(fā)生聚沉，這可能是因為Bmsage分子之間可能通過電荷-電荷相互作用結(jié)合，從而導致蛋白聚集沉淀。

大腸桿菌對外源基因的表達具有密碼子偏好性。分析發(fā)現(xiàn)，基因包含多個稀有密碼子，可能會影響其在大腸桿菌中的表達。Transetta (DE3)細胞可以補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，從而提高外源基因的表達水平。因此，在本實驗中我們選擇了Transetta (DE3)細胞作為表達菌株。

圖1 Bmsage基因結(jié)構(gòu)(A)及其蛋白結(jié)構(gòu)域 (B) 分析

2.2 基因的組織表達譜分析

根據(jù)5齡3天家蠶各組織芯片基因表達譜，繪制在不同組織中表達的熱圖。結(jié)果顯示，在家蠶絲腺中高量表達，而在頭部等其他組織中表達量較低 (圖2A)。定量分析 (圖2B) 顯示，無論在雄蠶前中部絲腺，還是后部絲腺中的表達量都比雌蠶在相同組織中的表達量高。一般來說，在相同的飼養(yǎng)條件下，同一品種雄蠶的產(chǎn)絲量要高于雌蠶。之前本實驗室的趙小明等發(fā)現(xiàn)，在家蠶絲腺中高量表達，并且其在5齡期與絲素重鏈基因表達趨勢一致。在后部絲腺，在高絲量品種872中的表達量要比低絲量品種大造的 高[14]。這些結(jié)果表明可能與家蠶絲腺合成蠶絲蛋白的主要功能相關(guān)。

2.3 蛋白序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

以Bmsage氨基酸序列為模板，通過Pubmed進行Blast分析。選取柑橘鳳蝶等物種的bHLH序列與Bmsage的bHLH序列進行多序列比對 (圖3)。結(jié)果表明，bHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在不同物種之間高度保守，暗示了bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在不同的物種中可能具有重要的生物學功能。

圖2 5齡3天家蠶Bmsage基因表達分析(A：不同組織中的表達熱圖分析. ♀：雌性；♂：雄性；Sg：性腺；Hd：頭；It：表皮；Fb：脂肪體；Mg：中腸；He：血細胞；Mt：馬氏管；A/MSG：前中部絲腺；PSG：后部絲腺.B：Bmsage在雌蠶和雄蠶絲腺中的表達差異分析)

以Blast結(jié)果為基礎(chǔ)，選取果蠅、蟻、蝶、蚊等物種中與Bmsage序列相似的蛋白構(gòu)建發(fā)育進化樹 (圖4)。結(jié)果顯示，家蠶與冬尺蠖蛾、柑橘鳳蝶的親緣關(guān)系最近，可以聚為一枝，其次是果蠅屬的各物種，而與蟻、虱等物種親緣關(guān)系較遠。

圖3 不同物種bHLH結(jié)構(gòu)域的多序列比對

圖4 家蠶Bmsage與其他物種同源蛋白的進化樹分析

2.4 表達載體構(gòu)建與可溶性表達分析

為研究Bmsage的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，利用PCR擴增獲得了基因，然后通過雙酶切將其構(gòu)建到pSKB2等載體中進行表達，其中pSKB2、ppSUMO和pCold-SUMO是以pET-28a (+) 載體為基礎(chǔ)改造而來，它們分別是將pET-28a (+) 中的Thrombin位點替換為PreScission和SUMO蛋白

酶切位點；pET 32M.3C中包含有6×His和Trx標簽和PreScission酶切位點；pET-MBP基于pET-32a (+) 載體改造而來，包含6×His和MBP標簽和煙草蝕紋病毒蛋白酶 (TEV) 酶切位點。

不同表達載體和表達條件下融合蛋白的表達效果如圖5所示。結(jié)果顯示，pSKB2-Bmsage (圖5A)、ppSUMO-Bmsage (圖5B)和pET 32M.3C-Bmsage (圖5F) 在37 ℃下融合蛋白以包涵體形式表達，而在其他溫度下可溶性蛋白的表達量較低，因此不適宜用這些載體表達可溶性的Bmsage。pCold-SUMO-Bmsage (圖5C) 在所有條件下都有表達，在16 ℃、0.1 mmol/L IPTG下表達較好。pET-50b (+)-Bmsage (圖5D) 在12 ℃和14 ℃下，融合蛋白主要以可溶性形式表達，在12 ℃、 0.1 mmol/L IPTG下表達較好。pET-MBP-Bmsage (圖5E) 在16 ℃、0.1 mmol/L IPTG下表達較好。有研究表明，30 ℃有助于大腸桿菌產(chǎn)生可溶有活性的蛋白。我們對部分表達載體設(shè)置為30 ℃誘導表達，發(fā)現(xiàn)其對Bmsage的可溶性表達影響不大，因此設(shè)置了12–16 ℃來篩選Bmsage的可溶性表達條件。根據(jù)以上結(jié)果，本實驗選擇pCold-SUMO-Bmsage、pET-50b (+)-Bmsage和pET-MBP-Bmsage載體，并根據(jù)它們最優(yōu)的表達條件來對Bmsage進行表達純化。

圖5 誘導溫度和IPTG濃度對不同重組表達載體表達Bmsage融合蛋白的影響(A：pSKB2-Bmsage；B：ppSUMO-Bmsage；C：pCold-SUMO-Bmsage；D：pET-50b(+)-Bmsage；E：pET-MBP-Bmsage；F：pET 32M.3C-Bmsage；M：分子量標準；Control、C：對照；S：上清；P：沉淀)

2.5 蛋白表達和純化

2.5.1 利用pET-50b (+) 表達和純化Bmsage

利用鎳柱親和層析對融合蛋白進行純化 (圖6A)，上樣緩沖液A為20 mmol/L Tris-HCl、 (pH 8.0)、500 mmol/L氯化鈉、10%甘油、 20 mmol/L咪唑，利用包含不同咪唑濃度的緩沖溶液分步洗脫。結(jié)果顯示，在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下得到的融合蛋白 (約90 kDa) 較純。將融合蛋白脫鹽并置換為酶切緩沖液B (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L氯化鈉，10%甘油，5 mmol/L β-巰基乙醇)，加入PreScission酶在4 ℃酶切16 h。酶切產(chǎn)物再次通過鎳柱以除去NusA標簽 (圖6B)。結(jié)果顯示，無論流穿，還是咪唑濃度梯度洗脫，Bmsage與NusA都不能被有效地分離。將圖6B中第4–6泳道的樣品收集除去咪唑后再次過鎳柱，蛋白損失較多，且仍然不能將Bmsage與NusA標簽完全分開。

2.5.2 利用pET-MBP表達和純化Bmsage

收集細胞，破碎離心后將上清通過鎳柱純化，利用15% SDS-PAGE檢測流穿和洗脫液(圖7A)。結(jié)果顯示，大部分His-MBP-Bmsage不與鎳柱結(jié)合，即使降低流速上樣，或者收集流穿二次上樣，也無法讓二者有效結(jié)合。利用包含不同咪唑濃度的緩沖溶液洗脫，在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下得到的融合蛋白 (約70 kDa) 較純。收集該融合蛋白并脫鹽置換為酶切緩沖液B，加入TEV酶酶切，酶切產(chǎn)物通過鎳柱以除去His-MBP標簽(圖7B)。結(jié)果顯示，部分融合蛋白沒有被TEV酶酶切，隨Bmsage一起出現(xiàn)在流穿中 (圖7B，泳道3)。利用不同濃度的咪唑分步洗脫，仍然不能將His-MBP標簽與Bmsage有效地分離。

圖6 借助pET-50b (+) 表達和純化Bmsage. (A) 鎳柱親和層析純化(1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：60、80、100和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過鎳柱純化(1：重組蛋白；2：重組蛋白被PreScission蛋白酶酶切；3：流穿；4–8：20、40、50、60和500 mmol/L咪唑洗脫液. M：蛋白分子量標準)

圖7 借助pET-MBP表達和純化Bmsage. (A)鎳柱親和層析純化(1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：40、60、80和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過鎳柱純化(1：重組蛋白；2：重組蛋白被TEV蛋白酶酶切；3：流穿；4–9：20、30、40、50、60和300 mmol/L咪唑洗脫液；M：蛋白分子量標準)

2.5.3 利用pCold-SUMO表達和純化Bmsage

利用鎳柱親和層析純化His-SUMO-Bmsage，收集流穿和洗脫液，進行SDS-PAGE檢測(圖8A)，發(fā)現(xiàn)在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下，獲得的His-SUMO-Bmsage (約55 kDa) 較純。將純化的融合蛋白脫鹽并置換為酶切緩沖液B，加入SUMO蛋白酶在4 ℃酶切16 h，再次通過鎳柱去除SUMO標簽 (圖8B)。結(jié)果顯示His-SUMO-Bmsage差不多被酶切完全，在流穿和40 mmol/L咪唑洗脫液中，可以檢測到純化的Bmsage，表明Bmsage與His-SUMO標簽可以被有效地分開。

2.6 六種重組表達載體的表達純化分析

本文利用6種表達載體對Bmsage在大腸桿菌中進行了表達，并選擇了可溶性表達較好的載體和表達條件進行了純化?，F(xiàn)將所有的表達和純化情況簡要總結(jié)于表1，其中表達水平取該表達系統(tǒng)所有誘導條件下的最優(yōu)值。結(jié)果顯示，pSKB2-Bmsage、pET 32M.3C-Bmsage、ppSUMO- Bmsage主要以包涵體的形式表達，無法用于下一步純化。pCold-SUMO-Bmsage、pET-50b(+)- Bmsage、pET-MBP-Bmsage部分以可溶性的形式在上清中表達，尤其是后兩者，可溶性融合蛋白的表達量較高，但是難以將Bmsage與融合標簽分離，而Bmsage與SUMO標簽則可以被有效地分開。因此，pCold-SUMO是Bmsage表達純化的最優(yōu)系統(tǒng)。

2.7 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

Bmsage屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，包含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。為證實純化的Bmsage是否包含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，利用遠紫外圓二色光譜對其二級結(jié)構(gòu)進行了分析 (圖9)。結(jié)果顯示，在圓二色光譜上208 nm與222 nm波長處有2個明顯的負峰，193 nm波長處有1個明顯的正峰，這些為α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征，表明純化獲得的Bmsage具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，推測其可能形成了類天然蛋白的空間構(gòu)象。

圖8 借助pCold-SUMO表達和純化Bmsage.(A) 鎳柱親和層析純化 (1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：40、60、80和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過鎳柱純化 (1：重組蛋白；2：重組蛋白被SUMO蛋白酶酶切；3：流穿；4–5：40和300 mmol/L咪唑洗脫液；M：蛋白分子量標準)

表1 6種重組表達系統(tǒng)的表達純化情況比較

“+” indicates the level of expression and solubility, and the effect of purification, the more the better. 0 presents no observable solubility, and blank area represents this experiment is not conducted.

圖9 Bmsage蛋白的遠紫外圓二色光譜

3 討論 蠶絲纖維因其優(yōu)異的性能而被譽為“纖維皇后”。蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠組成，其中主要成分是絲素。絲素由絲素重鏈、絲素輕鏈和P25按6∶6∶1的比例組成[20]，其中絲素重鏈是絲素蛋白中最重要的成分，它賦予了蠶絲纖維主要的力學性能。絲素重鏈基因的表達在轉(zhuǎn)錄水平受多種轉(zhuǎn)錄因子 (SGF-1、SGF-2、SGF-3、SGF-4、FMBP-1、FBF-A1、Bmdimm等)[21-24]的調(diào)控。自本實驗室劉春等[13]鑒定Bmsage以來， 研究表明Bmsage在絲蛋白合成[14]和絲腺器官發(fā)育[15]過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，然而迄今為止，對Bmsage的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)了解不多。本研究擬通過大腸桿菌原核表達純化Bmsage，從而為深入研究其結(jié)構(gòu)和功能建立基礎(chǔ)。 基因結(jié)構(gòu)、基因表達速率和蛋白理化性質(zhì)是影響外源基因在大腸桿菌中可溶性表達的主要因素?；蚪Y(jié)構(gòu)可以通過密碼子優(yōu)化或者利用攜帶稀有密碼子tRNA的表達菌株來克服其表達問題；基因表達速率可以通過降低誘導溫度和IPTG濃度來下調(diào)，從而使外源蛋白有充分的時間折疊形成正確的空間構(gòu)象促進其溶解；外源蛋白可以通過與親水的標簽融合表達來提高其在大腸桿菌中表達的可溶性。20世紀末，融合標簽技術(shù)快速發(fā)展起來，在輔助蛋白純化、提高外源蛋白表達產(chǎn)量、溶解性和穩(wěn)定性等方面顯示出了巨大的應(yīng)用價值。pET-50b(+)中的NusA[25]和pET-MBP中的MBP標簽[26-27]具有較好的親水性，可以幫助提高外源蛋白的可溶性；pCold-SUMO與ppSUMO中的SUMO標簽[28]不僅有助于提高外源蛋白的溶解性，還可以促進其在體內(nèi)的折疊；pET 32M.3C中的Trx標 簽[29]不僅能夠提高蛋白的溶解性，還能促進蛋白質(zhì)中二硫鍵的正確配對。本研究將NusA、MBP、SUMO和Trx等標簽分別與Bmsage融合表達，并利用Transetta (DE3)表達菌株，結(jié)合降低誘導溫度和IPTG濃度的方式成功實現(xiàn)了Bmsage在大腸桿菌中的可溶性表達。高中生物課程是學生學習的重要科目，對學生的綜合知識學習能力的提高有著積極作用，生物課堂教學過程中，注重教學方法的科學應(yīng)用比較關(guān)鍵，這也是促進教學質(zhì)量的重要舉措。通過從理論層面深化生物課堂生活化教學發(fā)展研究，能為實際教學工作的開展提供相應(yīng)參考。 我們的結(jié)果顯示，NusA與MBP標簽具有較好的助溶效果，能夠顯著地提高Bmsage的可溶性表達，這與其他的研究結(jié)果基本一致[30-31]。然而，當酶切之后，NusA標簽與Bmsage無法有效地分離。NusA標簽含有大量的酸性氨基酸殘基，等電點約為4.62，推測其可能與Bmsage中堿性氨基酸殘基之間存在非特異性電荷-電荷相互作用從而導致二者無法分開。His-MBP-Bmsage大部分不與鎳柱結(jié)合，并且不能被酶切完全，即使加大蛋白酶用量、延長反應(yīng)時間或者提高酶切反應(yīng)溫度也無法提高酶切產(chǎn)率，這可能是因為融合蛋白本身沒有折疊形成良好的空間結(jié)構(gòu)，從而導致組氨酸標簽和蛋白酶切位點被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，組氨酸標簽無法與鎳親和填料結(jié)合，同時TEV酶切位點兩端的MBP與Bmsage也可能會對TEV酶產(chǎn)生空間位阻，導致融合蛋白無法被TEV酶識別和切割。Trx標簽有助于富含二硫鍵蛋白的正確折疊，并且在一定程度上也能幫助提高外源蛋白的溶解性[30]，但其對于Bmsage的可溶性表達并沒有明顯的幫助。SUMO標簽可以幫助提高Bmsage的可溶性表達，其效果不如NusA與MBP標簽明顯，但經(jīng)過SUMO蛋白酶酶切后，SUMO標簽與Bmsage可以通過鎳柱被有效地分離。圓二色光譜顯示，利用SUMO標簽表達純化的Bmsage包含α-螺旋結(jié)構(gòu)，推測其可能折疊形成了類天然的空間結(jié)構(gòu)，這表明SUMO標簽不僅具有一定的助溶效果，而且也有助于Bmsage的正確折疊。 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在生命活動過程中具有多種重要的生物學功能，然而之前的研究很少涉及此類蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，這可能與其難以表達純化相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，Bmsage容易形成包涵體表達，并且易于聚沉，這可能與其氨基酸組成和性質(zhì)相關(guān)。本研究利用SUMO標簽和鎳親和層析的方法表達純化了Bmsage蛋白，為深入研究其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能建立了很好的基礎(chǔ)，同時，我們的研究對其他類似蛋白的表達和純化也有一定的借鑒意義。

REFERENCES：

[1] Massari ME, Murre C. Helix-loop-helix proteins: regulators of transcription in eucaryotic organisms. Mol Cell Biol, 2000, 20(2): 429–440.

[2] Ledent V, Paquet O, Vervoort M. Phylogenetic analysis of the human basic helix-loop-helix proteins. Genome Biol, 2002, 3(6): 1–18.

[3] Simionato E, Ledent V, Richards G, et al. Origin and diversification of the basic helix-loop-helix gene family in metazoans: insights from comparative genomics. BMC Evol Biol, 2007, 7: 33.

[4] Wang Y, Yao Q, Chen KP. Progress of studies on family members and functions of animal bHLH transcription factors. Hereditas (Beijing), 2010, 32(4): 307–330 (in Chinese). 王勇, 姚勤, 陳克平. 動物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員及其功能. 遺傳, 2010, 32(4): 307–330.

[5] Murre C, McCaw PS, Baltimore D. A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, myod, and myc proteins. Cell, 1989, 56(5): 777–783.

[6] Voronova A, Baltimore D. Mutations that disrupt DNA-binding and dimer formation in the E47 helix-loop-helix protein map to distinct domains. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(12): 4722–4726.

[7] Ferré-D'Amaré AR, Prendergast GC, Ziff EB, et al. Recognition by max of its cognate DNA through a dimeric b/HLH/Z domain. Nature, 1993, 363(6424): 38–45.

[8] Ma PC, Rould MA, Weintraub H, et al. Crystal-structure of MyoD bHLH domain-DNA complex-perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation. Cell, 1994, 77(3): 451–459.

[9] Imayoshi I, Kageyama R. bHLH factors in self-renewal, multipotency, and fate choice of neural progenitor cells. Neuron, 2014, 82(1): 9-23.

[10] Abrams EW, Mihoulides WK, Andrew DJ. Fork head and sage maintain a uniform and patent salivary gland lumen through regulation of two downstream target genes,and. Development, 2006, 133(18): 3517–3527.

[11] Fox RM, Vaishnavi A, Maruyama R, et al. Organ-specific gene expression: the bHLH protein sage provides tissue specificity toFoxA. Development, 2013, 140(10): 2160–2171.

[12] Wang Y, Chen KP, Yao Q, et al. The basic helix-loop-helix transcription factor family in. Dev Genes Evol, 2007, 217(10): 715–723.

[13] Liu C. Expression profile of silk gland and transcriptional regulation of silk fibroin structural genes of[D]. Chongqing: Southwest University, 2006 (in Chinese). 劉春. 家蠶絲腺表達譜及絲素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D]. 重慶: 西南大學, 2006.

[14] Zhao XM, Liu C, Li QY, et al. Basic helix-loop-helix transcription factor Bmsage is involved in regulation ofgeneinteraction with SGF1 in. PLoS ONE, 2014, 9(4): e94091.

[15] Xin HH, Zhang DP, Chen RT, et al. Transcription factor Bmsage plays a crucial role in silk gland generation in silkworm,. Arch Insect Biochem Physiol, 2015, 90(2): 59–69.

[16] Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947–2948.

[17] Robert X, Gouet P. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucleic Acids Res, 2014, 42: W320-W324.

[18] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. Mega6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol, 2013, 30(12): 2725–2729.

[19] Deng WK, Wang YB, Liu ZX, et al. Hemi: a toolkit for illustrating heatmaps. PLoS ONE, 2014, 9(11): e111988.

[20] Inoue S, Tanaka K, Arisaka F, et al. Silk fibroin ofis secreted, assembling a high molecular mass elementary unit consisting of H-chain, L-chain, and P25, with a 6: 6: 1 molar ratio. J Biol Chem, 2000, 275(51): 40517–40528.

[21] Hui CC, Suzuki Y. Enhancement of transcription from the Ad2 major late promoter by upstream elements of the fibroin-and sericin-1-encoding genes in silk gland extracts. Gene, 1989, 85(2): 403–411.

[22] Hui CC, Matsuno K, Suzuki Y. Fibroin gene promoter contains a cluster of homeodomain binding sites that interact with three silk gland factors. J Mol Biol, 1990, 213(4): 651–670.

[23] Takiya S, Kokubo H, Suzuki Y. Transcriptional regulatory elements in the upstream and intron of the fibroin gene bind three specific factors POU-M1, Bm Fkh and FMBP-1. Biochem J, 1997, 321(3): 645–653.

[24] Zhao XM, Liu C, Jiang LJ, et al. A juvenile hormone transcription factor Bmdimm-fibroin H chain pathway is involved in the synthesis of silk protein in silkworm,. J Biol Chem, 2015, 290(2): 972–986.

[25] De Marco V, Stier G, Blandin S, et al. The solubility and stability of recombinant proteins are increased by their fusion to NusA. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(3): 766–771.

[26] di Guan, Chu PL, Riggsa PD, et al. Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides inby fusion to maltose-binding protein. Gene, 1988, 67(1): 21–30.

[27] Lei RY, Qiao YH, Yan JD, et al. Soluble expression of recombinant human BMP6 inand its purification and bioassay. Chin J Biotech, 2008, 24(3): 452–459 (in Chinese). 雷榮悅, 喬玉歡, 閆繼東, 等. 重組人BMP6在大腸桿菌中可溶表達、純化及活性分析. 生物工程學報, 2008, 24(3): 452–459.

[28] Marblestone JG, Edavettal SC, Lim Y, et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci, 2006, 15(1): 182-189.

[29] Lavallie ER, Diblasio EA, Kovacic S, et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in thecytoplasm. Biotechnology (N Y), 1993, 11(2): 187–193.

[30] Dummler A, Lawrence AM, De Marco A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed inusing a modular set of vectors. Microb Cell Fact, 2005, 4: 1.

[31] Schrodel A, Volz J, De Marco A. Fusion tags and chaperone co-expression modulate both the solubility and the inclusion body features of the recombinant CLIPB14 serine protease. J Biotechnol, 2005, 120(1): 2–10.

(本文責編 郝麗芳)

Soluble expression, purification and structural analysis of the bHLH transcription factor Bmsage of

Huawei He1,2, Shuguang Wei1, Yejing Wang1,2, Lina Liu1, Zhenzhen Li1, Peng Zhao1, Huaipu Chang1,2, and Ping Zhao1

1,,400715,Chongqing Engineering and Technology Research Center for Novel Silk MaterialsCollege of BiotechnologySouthwest UniversityChongqingChina

Basic helix loop helix (bHLH) transcription factor plays an important role in biological processes. Bmsage is a class of bHLH transcription factor highly expressed in the silk gland of, which is not only involved in the developmental regulation of the silk gland cells at the embryonic period, but also plays a crucial regulatory role during the synthesis of silk protein. However, currently, much of the property and structure of Bmsage is still remained unknown. To study the property, structure and biological role of Bmsage, we constructed several prokaryotic expression vectors of Bmsage fused with NusA, MBP, SUMO, Trx and His tags, respectively, then screened and determined the best soluble expression vector and condition of Bmsage incombining with the induction temperature and IPTG concentration, and further purified the recombinant Bmsage by Ni-column affinity chromatography according to the established expression condition and characterized its secondary structure using circular dichroism spectra. The results showed that NusA and MBP could significantly enhance the soluble expression of Bmsage in, but it was difficult to separate Bmsage from these tags. SUMO could not only increase the soluble expression of Bmsage into a certain degree, but also be effectively separated from Bmsage. Other tags did not effectively promote the soluble expression of Bmsage in. Circular dichroism spectra showed that the purified Bmsage had well-defined α-helix structure in solution, indicating that SUMO may promote the correct folding of Bmsage into native-like structure. These work not only establish a foundation for further study of the property, structure and function of Bmsage, but also provide a reference for the expression and purification of other similar proteins.

basic helix-loop-helix, Bmsage, MBP, NusA, SUMO, purification

March 21, 2016; Accepted:May 12, 2016

Huawei He. Tel: +86-23-68251575; E-mail: hehuawei@swu.edu.cn

時間：2016-06-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160613.0955.001.html

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