威靈仙總皂苷對實驗性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝臟病理的影響*

閆福媛 琚 堅 高 藩 王曉青

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院特需病房科(650101)

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威靈仙總皂苷對實驗性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝臟病理的影響*

閆福媛#琚 堅&高 藩 王曉青

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院特需病房科(650101)

背景：中藥威靈仙化學成分多樣，藥理作用廣泛。前期研究顯示威靈仙能有效干預實驗性肝纖維化。目的：研究威靈仙總皂苷對實驗性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型血清炎癥細胞因子和肝臟病理的干預作用。方法：以高脂飼料飼養(yǎng)16周誘導實驗性NASH大鼠模型，分別予多烯磷脂酰膽堿和威靈仙總皂苷灌胃干預8周，同時設置不予藥物干預的模型組和以普通飼料飼養(yǎng)的空白組。以ELISA法檢測血清白細胞介素-6(IL-6)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活動度積分評估肝臟脂肪變性分度和炎癥分級。結(jié)果：經(jīng)8周藥物干預后，威靈仙總皂苷組血清IL-6、IL-17、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.01)，與空白組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，肝臟脂肪變性分度和炎癥分級亦較模型組顯著減輕(P<0.05)，與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿的作用無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：威靈仙總皂苷可有效改善實驗性NASH大鼠模型的肝臟脂肪變性和炎癥損傷，降低血清炎癥細胞因子水平，療效與多烯磷脂酰膽堿相當。其機制可能與調(diào)節(jié)肝臟免疫、對抗肝臟氧化應激、改善胰島素抵抗等有關(guān)。

威靈仙； 皂苷類； 非酒精性脂肪性肝炎； 白細胞介素6； 白細胞介素17； 腫瘤壞死因子α

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除外乙醇以及其他明確的肝損害因素，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪性肝病以及由其演變而來的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。NAFLD與酒精性脂肪性肝病的演進過程一致，依次為脂肪肝→脂肪性肝炎→脂肪性肝纖維化→肝硬化→肝癌，因此NASH是NAFLD發(fā)展為肝硬化乃至肝癌的關(guān)鍵步驟。中藥威靈仙是毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙、棉團鐵線蓮、東北鐵線蓮的干燥根和根莖，具有祛風濕、通經(jīng)絡之功效[2]。威靈仙化學成分多樣，目前研究最多的是其中的多糖類和皂苷類物質(zhì)。威靈仙皂苷成分藥理作用廣泛，包括免疫抑制[3]、抗氧化[4]、抗炎[4-5]、抗腫瘤[6]等。本課題組前期研究[7]顯示威靈仙能有效干預大鼠實驗性肝纖維化，效果與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿無明顯差異。本研究通過比較威靈仙總皂苷和多烯磷脂酰膽堿對實驗性NASH大鼠模型血清炎癥細胞因子和肝臟病理的干預作用, 探討應用威靈仙總皂苷治療NSAH的價值。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只，平均體質(zhì)量(70±10) g，購自昆明醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證：SCXK(滇)2005-0008。大鼠飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心，于安靜環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，室溫(22±2) ℃，濕度50%±5%，通風良好，自然晝夜光線，自由進食、飲水。豬油(昆明市農(nóng)貿(mào)市場)，蛋黃粉、膽固醇、膽酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)，多烯磷脂酰膽堿膠囊[228 mg/粒，商品名：易善復，國藥準字H20059010，賽諾菲(北京)制藥有限公司]，威靈仙總皂苷(安徽大學生命科學學院)，大鼠血清白細胞介素-6(IL-6)、IL-17 ELISA檢測試劑盒(eBioscience, Thermo Fisher Scientific Inc.)，大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(RayBiotech, Inc.)。

二、方法

1. 造模階段動物分組和NASH模型建立[8]：從50只大鼠中隨機抽取14只組成空白組，其余36只作為模型組?？瞻捉M予普通飼料飼養(yǎng)16 周；模型組予高脂飼料(82.5%普通飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉)飼養(yǎng)16 周。兩組分別于4、8、12、16周末各取1只、1只、2只、2只大鼠，處死后取出肝臟，在肝右葉中央部取1.0 cm×0.5 cm大小的肝組織，迅速于0.9% NaCl溶液中漂洗，4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，行HE染色，觀察肝組織病理學變化。檢查結(jié)果顯示高脂飼料飼養(yǎng)16周可成功建立實驗性NASH大鼠模型。

2. 藥物干預階段動物分組和干預：實驗性NASH大鼠模型成功建立后，原模型組剩余30只大鼠隨機分為模型組、多烯磷脂酰膽堿組和威靈仙總皂苷組，每組10只；原空白組剩余8只大鼠仍作為空白組。多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組大鼠分別予多烯磷脂酰膽堿(195.4 mg·kg-1·d-1)、威靈仙總皂苷(純度61.5%，50 mg·kg-1·d-1)，以 0.9% NaCl配制成3 mL溶液灌胃，模型組、空白組大鼠予0.9% NaCl溶液3 mL灌胃，每日上午9時灌胃一次，共8 周。

3. 血清標本采集和細胞因子檢測：藥物干預結(jié)束后，大鼠禁食、禁水24 h，3%戊巴比妥鈉0.10～0.15 mL/100 g腹腔麻醉，下腔靜脈采血，離心、分離血清，以ELISA法測定IL-6、IL-17、TNF-α水平，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

4. 肝組織病理學評估：藥物干預結(jié)束后腹腔麻醉處死大鼠，取出肝臟，病理切片制備同造模階段。參照中華醫(yī)學會肝病學分會制訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》進行NAFLD活動度積分(NAFLD activity score, NAS)評估[9]。肝細胞脂肪變性：0分，<5%；1分，5%～33%；2分，34%～66%；3分，>66%。小葉內(nèi)炎癥(20倍視野計數(shù)壞死灶)：0分，無；1分，<2個；2分，2～4個；3分，>4個。肝細胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見?？偡譃?～8分。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般情況

采用高脂飼料飼養(yǎng)16周可成功建立實驗性NASH大鼠模型，肝組織無肝纖維化?？瞻捉M大鼠肝臟大體觀察體積正常，表面光滑有光澤，色粉紅，觸之質(zhì)軟，肝組織切片未見明顯肝細胞脂肪變、氣球樣變、炎癥壞死或纖維化；模型組大鼠肝臟體積增大，表面光澤差，色淡黃，切之有油膩感，可見肝細胞脂肪變和較多氣球樣變，門管區(qū)大量炎性細胞浸潤(圖1)。

A、B：空白組；C、D：模型組；A、C：大體表現(xiàn)；B、D：組織學表現(xiàn)(HE染色，×200)

圖1 空白組和模型組大鼠高脂飲食16周末肝臟大體和組織 學表現(xiàn)

二、血清IL-6、IL-17、TNF-α水平

經(jīng)8周藥物干預后，多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組血清IL-6、IL-17、TNF-α水平均顯著低于模型組(P<0.01)，多烯磷脂酰膽堿組與威靈仙總皂苷組間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩組與空白組間差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

三、肝臟脂肪變性分度和炎癥分級

8周末，模型組表現(xiàn)為Ⅳ度肝細胞脂肪變性，肝細胞較多氣球樣變，部分門管區(qū)少量炎性細胞浸潤，小葉內(nèi)多數(shù)有灶狀壞死。多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組經(jīng)8周藥物干預后，肝臟脂肪變性分度和炎癥分級較模型組顯著減輕(P<0.01,P<0.05)，多烯磷脂酰膽堿組與威靈仙總皂苷組間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但兩組仍顯著高于空白組(P<0.01)(表2)。

表2 各組肝臟脂肪變性分度、炎癥分級比較

*與空白組比較，P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01

討 論

中藥威靈仙化學成分復雜，主要有揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分兩大類，前者主要包括棕櫚酸3-羥基-4-甲氧基苯甲醛、二十碳烷等，后者主要包括三萜及其苷類、黃酮和多元酚類、有機酸類、生物堿類等[10]。威靈仙的藥理作用廣泛，如苷類中的原白頭翁素和白頭翁素有抑菌、抗菌活性；皂苷類具有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫抑制、抗纖維化、抗氧化、抗腫瘤、降低尿酸作用；多糖類具有抗腫瘤、抗氧化作用；黃酮類有利膽作用等[3-6,10-11]。文獻報道皂苷元齊墩果酸可對多種原因引起的急性肝損傷發(fā)揮保護作用，并具有抑制肝星狀細胞(HSC)收縮、抗肝纖維化、抗門靜脈高壓作用[12-13]。本研究通過血清炎癥細胞因子IL-6、IL-17、TNF-α檢測以及肝臟脂肪變性分度和炎癥分級評估，對威靈仙化學成分中的總皂苷對NASH這一NAFLD進展至肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)的干預作用及其可能機制進行了探討。

表1 各組血清炎癥細胞因子水平比較±s, pg/mL)

*與模型組比較，P<0.01

IL-6是一種促炎細胞因子，然而關(guān)于其在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中是起正性還是負性作用，目前并無明確的循證醫(yī)學證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6能抑制胰島素受體底物1(IRS1)，從而影響胰島素受體與底物結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導，導致胰島素抵抗發(fā)生[14-16]。然而亦有研究[17]指出，盡管一般程度地阻斷IL-6-STAT3信號通路可減輕NASH肝損傷，但對于重度NASH，IL-6信號是一個保護因素，以蛋氨酸膽堿缺乏飲食在db/db肥胖小鼠(本身即存在STAT3活化受損)中誘導NASH，予抗小鼠IL-6受體特異性抗體以進一步阻斷STAT3活化可增強肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化/氧化應激，進而加重肝損傷。Kroy等[18]的研究顯示，以膽堿缺乏乙硫氨酸補充飲食誘導NASH，IL-6缺陷小鼠更易發(fā)生肝臟脂肪變性和炎癥損傷，導致重度NASH，伴高糖血癥和血清胰島素水平升高。Miller等[19]發(fā)現(xiàn)，抗炎細胞因子IL-10缺陷小鼠出現(xiàn)嚴重的肝臟炎癥反應，伴IL-6水平升高和STAT3激活，但給予乙醇或高脂飲食后并不發(fā)生嚴重肝臟脂肪變性和肝細胞損傷，在IL-10缺陷小鼠中敲除IL-6或STAT3則可引起肝臟脂肪變性和肝細胞損傷，且肝臟炎癥反應進一步加重，提示IL-6-STAT3信號激活有抗脂肪變性作用。本研究中實驗性NASH大鼠模型血清IL-6水平顯著升高，這提示對于NASH的發(fā)生、發(fā)展，IL-6主要起促進作用。

IL-17是由Th17細胞分泌的重要的促炎細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)肥胖人群中存在IL-17軸激活，在NAFLD的發(fā)生以及由單純性脂肪性肝病向NASH轉(zhuǎn)變中起極為重要的作用[20-21]。在IL-17A受體(IL-17RA)缺陷小鼠中，高脂飲食可引起內(nèi)臟脂肪沉積、肝臟脂肪變性，但并不發(fā)生嚴重的脂肪性肝炎和肝細胞損傷[20]。體外實驗發(fā)現(xiàn)IL-17可引起胰島素抵抗，導致肝細胞發(fā)生脂肪變性；高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟中Th17細胞數(shù)量顯著增多，予中和IL-17后，模型小鼠由脂多糖誘導的肝損傷明顯減輕，血清ALT水平降低，肝臟炎癥細胞浸潤減少；NASH患者肝臟中IL-17陽性細胞浸潤亦顯著增多[21]。本研究中，實驗性NASH大鼠模型血清IL-17水平升高顯著，與上述研究結(jié)果相符。

目前研究認為TNF-α可通過多條途徑促進NAFLD進展：①誘導STAT3表達，抑制胰島素受體，從而阻礙胰島素信號轉(zhuǎn)導，引起胰島素抵抗[15]。②誘導低密度脂蛋白受體表達，抑制膽固醇向肝外轉(zhuǎn)運，導致肝內(nèi)膽固醇蓄積，消耗線粒體中的谷胱甘肽，使肝細胞中活性氧生成增加，加劇氧化應激，加重肝細胞損傷[22]。此外，肝細胞內(nèi)有大量脂質(zhì)蓄積時，TNF-α可上調(diào)細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)表達，激活蛋白激酶通路，導致肝細胞損傷、凋亡[23]。本研究中，實驗性NASH大鼠模型血清TNF-α水平升高顯著，證實其參與了NASH的發(fā)生。

本組實驗性NASH大鼠模型經(jīng)威靈仙總皂苷干預8周后，肝臟脂肪變性和炎癥損傷明顯減輕，同時血清IL-6、IL-17、TNF-α降低至正常水平，與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿療效相當。推測威靈仙總皂苷可能通過改善肝臟脂肪變性、減輕肝細胞炎癥、調(diào)節(jié)肝臟免疫、對抗肝臟氧化應激、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝臟Kupffer細胞吞噬功能等途徑[15]，降低NASH大鼠模型的血清炎癥細胞因子水平，減輕肝組織損傷，達到有效治療和改善NASH的目的。確切機制有待進一步深入探討。

NAFLD是一組多機制、多進程的代謝性疾病，其發(fā)病機制錯綜復雜，主流觀點為“二次打擊”學說。炎癥因子中的細胞因子作為“二次打擊”學說中“第二次打擊”的關(guān)鍵因素，在 NASH的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前尚無針對NASH的特效藥物，因此闡明細胞因子在NAFLD疾病進程中的作用機制及其確切作用環(huán)節(jié)，尋找其中的關(guān)鍵因子作為NASH治療的靶點具有廣泛臨床應用前景。威靈仙總皂苷能有效降低高脂飲食誘導的NASH大鼠模型的血清IL-6、IL-17、TNF-α水平，改善肝臟病理表現(xiàn)，或許能為NASH的治療和預防提供新思路。本實驗樣本量較小，抽樣誤差大，且高脂飼料飼養(yǎng)大鼠16周無法建立肝纖維化模型，后續(xù)研究擬擴大樣本量，建立有肝纖維化表現(xiàn)的大鼠模型并行纖維化Masson染色以彌補上述缺陷，明確威靈仙總皂苷對肝纖維化是否有預防和治療作用。

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(2016-01-18收稿；2016-02-04修回)

Effect of Total Saponins of Radix clematidis on Serum IL-6, IL-17, TNF-α and Liver Pathology in Experimental NASH Rats

YANFuyuan,JUJian,GAOFan,WANGXiaoqing.

DepartmentofSpecialWard,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming(650101)

JU Jian, Email: jujianyn@163.com

CLEMATIS CHINENSIS; Saponins; Non-Alcoholic Steatohepatitis; Interleukin-6;Interleukin-17; Tumor Necrosis Factor-alpha

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.09.003

云南省衛(wèi)生科技計劃基金(2012WS0091)

#Email: 2374322904@qq.com

&本文通信作者，Email: jujianyn@163.com

Background: Radix clematidis is a Chinese herbal medicine with complex chemical components and broad pharmacological activities. It has been demonstrated that Radix clematidis is effective in treating experimental liver fibrosis. Aims: To investigate the intervention effect of total saponins of Radix clematidis on serum inflammatory cytokines and liver pathology in rats with experimental non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Methods: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet for 16 weeks to induce experimental NASH and then received polyene phosphatidyl choline or total saponins of Radix clematidis intragastrically for 8 weeks. Rats fed with high fat diet without drug intervention and rats fed with normal diet were served as NASH control and blank control, respectively. Serum levels of interleukin-6 (IL-6), IL-17 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA method, the hepatic steatosis and inflammation were evaluated by using non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score. Results: After 8 weeks intervention, serum levels of IL-6, IL-17 and TNF-α were significantly decreased in total saponins group than in NASH control group (P<0.01), and no significant difference was seen between total saponins group and blank control group (P>0.05). Severity of hepatic steatosis and inflammation were also reduced markedly in total saponins group (P<0.05). The efficacy of total saponins of Radix clematidis was similar to that of polyene phosphatidyl choline, a commonly used hepatoprotective agent (P>0.05). Conclusions: Total saponins of Radix clematidis is effective for ameliorating hepatic steatosis and inflammatory injury and reducing serum inflammatory cytokines in rats with experimental NASH, the efficacy is equal to polyene phosphatidyl choline. Total saponins of Radix clematidis may exerts the therapeutic effect on NASH by its immunomodulation, antioxidant and anti-insulin resistance activities.