真空冷凍干燥后藻藍(lán)蛋白提取工藝及穩(wěn)定性的研究

劉玉環(huán)，李彩霞，李冬蓮

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖　734000)

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真空冷凍干燥后藻藍(lán)蛋白提取工藝及穩(wěn)定性的研究

劉玉環(huán)，李彩霞，李冬蓮

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000)

為拓寬極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的應(yīng)用范圍，研究了溫度、時間、pH值、固液比對其提取工藝及金屬離子、食品添加劑等因素對其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：藻藍(lán)蛋白的最佳提取工藝為溫度30℃、反應(yīng)時間1.5h、Na2HPO4-檸檬酸緩沖液pH值7.0，固液比1∶60，在此條件下藻藍(lán)蛋白的提取率達(dá)最大值。藻藍(lán)蛋白在pH值5.0～7.0，溫度30℃，室內(nèi)可見光或暗光條件下較穩(wěn)定；淀粉、蔗糖、明膠、苯甲酸鈉等食品添加劑與低濃度條件下的氧化劑和還原劑對其穩(wěn)定性影響不顯著；金屬離子Na+、K+、Mg2+和低濃度的Ca2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Cu2+對其穩(wěn)定性無影響。因此，藻藍(lán)蛋白在弱酸性環(huán)境、低金屬離子濃度及常用食品添加劑等條件下較穩(wěn)定，可將其作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。

極大螺旋藻；藻藍(lán)蛋白；提取工藝；穩(wěn)定性

螺旋藻具有蛋白含量高、繁殖速度快等特點[1]。螺旋藻中藻膽含量約占藻體干重的10%～25%[2]，主要包括藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白三類[3]。近年來，國內(nèi)外研究表明，螺旋藻中含有大量蛋白質(zhì)及各種營養(yǎng)物質(zhì)，其中活性多糖與藻藍(lán)蛋白具有抗癌、抗氧化、提高免疫力等活性功能，藻藍(lán)蛋白還可作為天然色素或熒光試劑，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值[4]和廣闊的前景[5]。螺旋藻種類主要有極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽澤螺旋藻等三類，用于保健品生產(chǎn)的螺旋藻主要是極大螺旋藻和鈍頂螺旋藻。目前對鈍頂螺旋藻的研究較多，但在極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取及其穩(wěn)定性研究方面鮮見報道。因此，本文對極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取工藝及其穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，旨在為極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料、試劑及儀器

材料：極大螺旋藻(Spirulinamaxima)，由甘肅省河西學(xué)院凱源微藻中心提供。

試劑：Na2HPO4、 檸檬酸、 NaCl、 MgCl2·6H2O、 KCl、 FeCl3·6H2O、 AlCl3·6H2O、 ZnSO4·7H2O、 CuSO4·5H2O、 CaCl2、淀粉、明膠、蔗糖、苯甲酸鈉、抗壞血酸、雙氧水等，均為分析純。

儀器：數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4(常州國華電器有限公司)、電子天平、722S 型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、760CRT-雙光束紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器廠)、游標(biāo)卡尺、LGF-30F 冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

2　極大螺旋藻藻粉制備

2.1材料準(zhǔn)備

取一定量的極大螺旋藻置于4個物料盤中鋪平，用游標(biāo)卡尺測量其厚度為4mm[6]。

2.2真空冷凍干燥

真空冷凍干燥過程分為以下3個階段[7]：預(yù)冷凍階段—升華干燥階段—解析干燥階段；預(yù)冷凍(5～6h)達(dá)到-50℃ 后打開真空泵進(jìn)入升華干燥階段，此階段耗時較長；當(dāng)隔板溫度達(dá)到設(shè)定的最高溫度40℃時，物料進(jìn)入解析干燥階段，并在這一溫度下進(jìn)行干燥至干燥完成；當(dāng)冷凍箱真空度下降到一定值不再變化后，整個干燥工藝結(jié)束。

3　極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取

3.1藻藍(lán)蛋白最大吸收峰的測定

準(zhǔn)確稱取0.5g極大螺旋藻藻粉，以1∶60的固液比溶于pH值7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中，30℃水浴恒溫提取1.5h，離心(2 000r/min，10min)后取上清液于波長280～700nm 范圍內(nèi)測其吸光值，并確定藻藍(lán)蛋白的最大吸收峰[8]。

3.2單因素對藻藍(lán)蛋白提取率的影響

固定其他條件，按步驟3.1處理后，在波長為618nm處分別考察pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)、提取溫度(30、40、50、60、70、80、90℃)、固液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)對藻藍(lán)蛋白提取率的影響。

3.3正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗設(shè)計，以pH值、提取時間、提取溫度和固液比為考察因素，以提取液的吸光值為考察指標(biāo)，研究各因素對藻藍(lán)蛋白提取率的影響，從而確定最佳提取工藝條件(表1)。

表1　正交試驗因素與水平

4　極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性試驗

4.1藻藍(lán)蛋白提取

藻藍(lán)蛋白提取步驟同3.1。

4.2不同因素對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響

4.2.1pH值準(zhǔn)確移取1mL提取液7份于已編號的試管中，用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的緩沖溶液定容至10mL，混合均勻后于暗光下靜置，每隔12h測其OD618[9]。比較不同pH值對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響。

4.2.2溫度依據(jù)3.2所得結(jié)果，準(zhǔn)確移取1mL提取液3份于已編號的試管中，分別用不同pH值(5.0、6.0、7.0)的緩沖溶液定容至10mL，混合均勻后于不同溫度(20、30、40、50、60、70、80、90℃)下水浴保溫，每隔30min測其OD618[10]。比較不同溫度對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響。

4.2.3光照準(zhǔn)確移取1mL提取液于已編號的試管中，分別用不同pH值(5.0、6.0、7.0)的緩沖溶液定容至10mL，混合均勻后于光照、室內(nèi)可見光、室內(nèi)避光條件下貯存，每隔30min測其OD618[11]。比較不同光照條件對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響。

4.2.4食品添加劑準(zhǔn)確移取1mL提取液于已編號的試管中，分別用不同濃度梯度(W/V)的淀粉、明膠、蔗糖、苯甲酸鈉、抗壞血酸、雙氧水溶液稀釋至10mL[12]，混合均勻后于室溫下靜置，經(jīng)10 h后測其OD618[13]。比較不同食品添加劑對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響。

4.2.5金屬離子分別配制濃度為0.1mol/L 的NaCl、 MgCl2·6H2O、 KCl、 FeCl3·6H2O、 AlCl3·6H2O、 ZnSO4·7H2O、 CuSO4·5H2O、 CaCl2母液25mL[14]，再分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL母液稀釋至10mL，試驗過程同4.2.4。比較不同金屬離子對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響。

4.2.6統(tǒng)計分析每個樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。用Microsoft Office 2003 的Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單處理，用Originpro8.5軟件作圖。

5　結(jié)果與分析

5.1極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白可見吸收光譜

由圖1可知，極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白在紫外-可見光范圍內(nèi)的最大吸收光譜為618nm[15]，該結(jié)果與張昆等從螺旋藻中提取天然食用色素的研究結(jié)果相一致。

圖1　極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白紫外可見吸收光譜

5.2各因素對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響及分析

5.2.1pH值由圖2 可知，當(dāng)提取液的pH值<4.0時溶液顏色較淡，藻藍(lán)蛋白含量較低；pH值>4.0 時藻藍(lán)蛋白含量隨pH值的增大呈顯著增加的趨勢，且在pH值7.0時達(dá)到最大；當(dāng)pH值繼續(xù)增大時，藻藍(lán)蛋白的含量顯著降低，主要是由于堿性條件下不利于藻藍(lán)蛋白的提取。由上述分析可知，在pH值為7.0時藻藍(lán)蛋白的提取效果最好。

圖2　pH對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響

5.2.2時間pH值為7.0、固液比為1∶60、溫度為30℃的條件下，時間對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響如圖3所示。從圖3中可以看出提取時間在1.5h時，提取液的吸光值較大，說明此時提取液中藻藍(lán)蛋白的含量較多；隨著提取時間繼續(xù)延長，提取液的吸光值呈下降的趨勢，說明藻藍(lán)蛋白的提取時間不宜過長，否則會導(dǎo)致色素的降解。因此，藻藍(lán)蛋白的最適提取時間為1.5h。

圖3　時間對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響

5.2.3溫度由圖4可知，溫度對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響較顯著。當(dāng)溫度在30～40℃ 時，提取液的吸光值隨溫度增加呈先增大后減小的趨勢；溫度在40～60℃ 時，吸光值顯著降低；當(dāng)溫度>60℃且繼續(xù)增加時，吸光值變化不顯著，說明藻藍(lán)蛋白在溫度>60℃時已變性，不利于提取。綜上所述，藻藍(lán)蛋白的最佳提取溫度為30℃。

圖4　溫度對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響

5.2.4固液比由圖5可知，pH值為7.0、時間為1.5h、溫度為30℃ 的條件下，藻藍(lán)蛋白的提取率與固液比呈正相關(guān)，當(dāng)固液比大于1∶50且繼續(xù)增加時，提取液的吸光值也在增大但變化不顯著，因此，將1∶60作為提取藻藍(lán)蛋白的最適固液比。

圖5　固液比對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響

5.3正交試驗

通過表2極差分析可知，各因素對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響為D>B>A>C，即：固液比>時間>pH>溫度，對藻藍(lán)蛋白提取效果影響最大的因素是固液比。最佳提取條件為：D3B3A2C1，即在溫度30℃、pH值7.0、提取時間1.5h、固液比1∶60的條件下，藻藍(lán)蛋白的提取效果最好。

表2　正交試驗結(jié)果

5.4藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性試驗結(jié)果及分析

5.4.1pH值由圖6可知，隨著靜置時間的增加，pH值3.0的管底有沉淀出現(xiàn)，且溶液顏色逐漸變淺，48h時上清液顏色幾乎接近無色；12h后pH值4.0的管中呈現(xiàn)膠狀，但無沉淀；pH值為5.0～8.0的各管溶液澄清且顏色依次加深，色素殘存率為97.28%；pH值5.0 時隨著時間的增加溶液的吸光值變化不顯著，說明藻藍(lán)蛋白在此pH值下最穩(wěn)定。由上述分析可知，藻藍(lán)蛋白在pH值5.0～7.0時穩(wěn)定性最好。

圖6　pH藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性影響

5.4.2溫度溫度-pH值雙因素對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響如圖7所示，當(dāng)溫度為25～50℃、pH 值為5.0、6.0、7.0時，溶液的吸光值變化不顯著，說明影響藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的因素除溫度外還與pH值有關(guān)；隨著溫度繼續(xù)升高，溶液的吸光值呈顯著降低的趨勢，且溶液的pH值越大，其吸光值變化越顯著。因此，藻藍(lán)蛋白在弱酸性[16]、低于50℃的條件下使用時穩(wěn)定性較好。

圖7　溫度對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響

5.4.3光照光照-pH值雙因素對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響如圖8所示，當(dāng)pH值為5.0、6.0、7.0時，隨著光照時間的延長，溶液顏色在強(qiáng)光下呈極顯著下降趨勢，150min時pH值為7.0的溶液顏色接近無色，而在室內(nèi)暗光和低溫避光條件下溶液的吸光值變化非常小。因此，極大螺旋藻產(chǎn)品的貯存應(yīng)是在室內(nèi)暗光或者低溫避光條件下保存，以防有效成分藻藍(lán)蛋白被光破壞。

圖8　光對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響

5.4.4食品添加劑如圖9、10、11所示，明膠、蔗糖、淀粉、苯甲酸鈉對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響不顯著。當(dāng)抗壞血酸的濃度大于0.4%時，溶液會出現(xiàn)乳狀，不澄清，并且透明度隨濃度的增大而降低。雙氧水雖然不會使藻藍(lán)蛋白溶液出現(xiàn)渾濁，但經(jīng)過10h后藻藍(lán)蛋白含量顯著降低。

圖9　明膠對藻藍(lán)蛋白的影響

圖10　蔗糖對藻藍(lán)蛋白的影響

圖11　淀粉、抗壞血酸、苯甲酸鈉、雙氧水對藻藍(lán)蛋白的影響

5.4.5金屬離子從表3可以看出，Na+、K+、Mg2+對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響不顯著；Fe3+、Al3+和Zn2+的濃度小于0.002mol/L 時藻藍(lán)蛋白較穩(wěn)定，當(dāng)濃度大于0.002mol/L并繼續(xù)增加時溶液出現(xiàn)乳狀或沉淀，Cu2+和Ca2+濃度大于0.004mol/L時溶液出現(xiàn)乳狀或沉淀。

表3　5h后各單金屬離子對藻藍(lán)蛋白的影響

6　結(jié)論與討論

本文利用光譜分析得出藻藍(lán)蛋白在可見光內(nèi)波長為618nm處有最大吸收峰值。通過單因素和正交試驗得出極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的最佳提取工藝為pH值7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液、固液比1∶60、30℃水浴提取1.5h，該工藝簡單、操作方便，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。藻藍(lán)蛋白在pH值5.0～7.0、溫度在25～50℃范圍內(nèi)，室內(nèi)可見光或暗光下較穩(wěn)定；食品添加劑如淀粉、明膠、蔗糖、苯甲酸鈉對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響不顯著，抗壞血酸濃度小于0.4%對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響較小，雙氧水對其影響較大；金屬離子如Na+、K+、Mg2+對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響不顯著，F(xiàn)e3+、Al3+、Zn2+的濃度小于0.002mol/L 時對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響不顯著，Cu2+和Ca2+濃度小于0.004mol/L時對其穩(wěn)定性影響不顯著，當(dāng)濃度超過以上范圍時會嚴(yán)重影響藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性。

綜上所述，本試驗通過對極大螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取工藝及其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，且首次研究了溫度-pH值和光照-pH值雙因素對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，旨在為極大螺旋藻在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。◇

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Extraction Technology and Stability of Phycocyanin from Spirulina maxima by Vacuum Freeze-drying

LIU Yu-huan，LI Cai-xia，LI Dong-lian

(College of Agriculture and Biology Technology，Hexi University，Zhangye 734000，China)

To broaden the scope of application ofSpirulinamaximaphycocyanin，we studied the influences of temperature，time，pH，solid-liquid ratio on the extraction process and metal ions，food additives and other factors on the stability.The results indicated that the optimum extraction technology of phycocyanin required reaction temperature 30℃，reaction time 1.5 h，Na2HPO4-citric acid buffer pH 7.0，solid-liquid ratio 1∶60，under the optimal reaction conditions，the extraction rate of phycocyanin reached maximum.Under the condition of pH 5.0～7.0，temperature 30℃，indoor visible light or dark，phycocyanin was relatively stable, Starch，sucrose，gelatin，sodium benzoate with other food additives and low concentration of oxidant and reducing agent showed no significant influence on its stability, The metal ions such as Na+,K+,Mg2+and low concentration of Ca2+,Zn2+,Al3+,Fe3+,Cu2+had no effect on the phycocyanin stability.In conclusion，the phycocyanin was relatively stable under the conditions of weak acid environment，low metal ions concentration and common food additives，which could be used as natural pigment widely used in food industry.

Spirulinamaxima；phycocyanin；extraction technology；stability

甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師科研項目(項目編號：0909—1)。

劉玉環(huán)(1963—)，男，學(xué)士，副教授，研究方向：園產(chǎn)品貯藏與加工。