DKK1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌線性程序性壞死和血管生成擬態(tài)形成*

姚伶俐張丹芳②趙秀蘭董學(xué)易劉芳林賢孫俊英鄭旭

·臨床研究與應(yīng)用·

DKK1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌線性程序性壞死和血管生成擬態(tài)形成*

姚伶俐①?gòu)埖し饥佗谮w秀蘭①董學(xué)易①劉芳①林賢①孫俊英①鄭旭①

目的：探討非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中DKK1影響線性程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）和血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）的機(jī)制。方法：收集人NSCLC標(biāo)本173例，H&E染色檢測(cè)LPPCN，CD31/PAS雙染檢測(cè)VM，免疫組織化學(xué)檢測(cè)DKK1及相關(guān)蛋白表達(dá)，分析其臨床病理意義及相互關(guān)系，進(jìn)而裸鼠H460-DKK1移植瘤體內(nèi)驗(yàn)證研究假設(shè)。結(jié)果：NSCLC中14.45%（25/173）存在VM，49.71%（86/173）具有LPPCN，LPPCN（+）組25.6%（22/ 86）形成VM，二者均與分化差、TNM分期晚、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)。VM（+）組和LPPCN（+）組DKK1均高表達(dá)，均與VE-cadherin、MMP-2、β-catenin核表達(dá)及Twist1正相關(guān)。H460-DKK1移植瘤模型證實(shí)DKK1促進(jìn)VM和LPPCN及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：DKK1引起的β-catenin、Twist1表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)NSCLC中LPPCN和VM形成。

非小細(xì)胞肺癌 血管生成擬態(tài) DKK1 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 線性程序性壞死

腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤血管生成，目前已知的腫瘤微循環(huán)模式包括內(nèi)皮依賴性血管、腫瘤血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）和馬賽克血管［1-2］。VM是腫瘤細(xì)胞通過自身變形和與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用模仿內(nèi)皮細(xì)胞圍成管腔樣結(jié)構(gòu)，并與內(nèi)皮依賴性血管連通，成為腫瘤的功能性血管，在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等10余種腫瘤內(nèi)均發(fā)現(xiàn)VM存在［1，3-5］，存在VM的腫瘤惡性度明顯高于無VM的腫瘤［1］，常規(guī)的以血管內(nèi)皮為靶點(diǎn)的抗血管生成藥物對(duì)存在VM的腫瘤療效不佳［1，6］。因此，研究VM形成的分子調(diào)控機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)是改善具有VM腫瘤患者不良預(yù)后的關(guān)鍵。前期研究發(fā)現(xiàn)存在VM的腫瘤組織中可見一類特殊類型的壞死細(xì)胞，胞體縮小、染色質(zhì)高度凝集、排列成線狀、表達(dá)凋亡相關(guān)基因。因此課題組將這類細(xì)胞死亡形式命名為“線形程序性壞死”（linearly patterned programmedcell necrosis，LPPCN）［7-8］。LPPCN走行與VM一致，提示LPPCN細(xì)胞死亡后形成的裂隙狀結(jié)構(gòu)可成為VM的空間基礎(chǔ)，但具體塑型過程和分子機(jī)制尚不清楚。

經(jīng)典Wnt通路即Wnt/β-catenin通路的異?；罨驯蛔C實(shí)與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］，前期研究發(fā)現(xiàn)Wnt拮抗劑Dickkopf（DKK）分泌蛋白家族成員DDK1通過促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）促進(jìn)VM形成［3］，且存在VM的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中均有LPPCN，因此假說DKK1是調(diào)控NSCLC LPPCN和VM形成的關(guān)鍵分子。本研究通過人體標(biāo)本、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動(dòng)物模型研究DKK1對(duì)NSCLC LPPCN和VM形成的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1病例資料

收集1990年10月至2010年11月于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌173例，回顧性分析臨床病理資料及腫瘤壞死面積等，隨訪截止至2013年5月1日。根據(jù)WHO（2015）肺癌診斷和TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)習(xí)切片并將其分為三類：鱗狀細(xì)胞癌、浸潤(rùn)性腺癌和其它類型癌。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色及計(jì)數(shù)本研究兔、羊或小鼠源性多克隆一抗體包括CD31（Zymed，1A10）、DKK1（Santa，SC-25516）、E-cadherin（Santa，SC-7870）、MMP2（Zymed，CA-4001）、MMP9（Santa SC-6840）、Slug（LifespanLS-B3449）、Twist1（Santa，SC-15393）、VE-cadherin（Abcam，Ab33168）、vimentin（Epitomics，EPR3776）、β-catenin（Zymed，CAT-5H10）、MMP-2（Zymed，CA-4001）、MMP-9（Santa，SC-6840）和endomucin（eBioscience，lot：E028994），相應(yīng)二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按SP兩步法操作，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫封閉30 min，微波修復(fù)抗原，血清封閉，一抗4℃過夜，次日二抗室溫孵育60 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，樹膠封片。

人體標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色結(jié)果按Mattern積分法計(jì)數(shù)［10］：每例切片選擇5個(gè)高倍視野（×400），以陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：無陽性著色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；陽性強(qiáng)度：無陽性為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)和陽性強(qiáng)度乘積為最后得分，＞3分視為陽性表達(dá)。

1.2.2CD31/PAS雙重染色及結(jié)果判定采用CD31/ PAS雙重染色檢測(cè)VM，具體步驟如下：常規(guī)CD31免疫組織化學(xué)染色至DAB顯色，滴加1%過碘酸溶液中反應(yīng)15 min，蒸餾水沖洗，滴加雪夫氏液，37℃避光孵育約20 min，蒸餾水沖洗3次，蘇木素復(fù)染，樹膠封片。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞株H460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心，采用RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清（FBS），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。pcDNA3.1-DKK1過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司（forward primer：5'-CTAGCTAGCACATGATGGCTCT GG-3'，reverse primer：5'-GGAATTCGTGTCTCTGAC AAGTGTG-3'）。常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選單克隆后，將質(zhì)粒進(jìn)行大量提取，PEI轉(zhuǎn)染6 h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入G418篩選。

1.2.4裸鼠移植瘤模型選取20只3～4周齡雄性BALB/c裸鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DKK1質(zhì)粒的H460細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種至小鼠右側(cè)腋窩皮下，1×107個(gè)細(xì)胞/只小鼠。每天觀察小鼠情況，測(cè)量移植瘤體積（體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2），21天后處死小鼠，收集腫瘤組織，制備石蠟包埋切片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間的差異采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier法生存分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VM和LPPCN的臨床病理意義

CD31/PAS雙重染色顯示在173例NSCLC組織中14.45%（25/173，圖1）存在VM，VM陽性組和VM陰性組腫瘤病理類型、分化程度、TNM分期及復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移存在差異。存在VM的腫瘤病理類型多為鱗癌和浸潤(rùn)性腺癌，分化程度低，TNM分期晚，易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移（表1）。173例NSCLC組織中49.71%（86/173，圖1）具有LPPCN，LPPCN細(xì)胞呈梭形，胞漿濃縮，胞核深染，呈線狀、條帶狀、網(wǎng)絡(luò)狀分布，走行在血管或VM周邊。LPPCN陽性組腫瘤多為中央型，分化程度低，TNM分期晚，易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。Kaplan-Meier生存分析顯示VM陽性組較VM陰性組患者生存時(shí)間短（χ2= 6.178，P=0.013），LPPCN陽性組較陰性組患者預(yù)后生存差（χ2=2.288，P=0.040）。

2.2VM、LPPCN和腫瘤壞死面積之間的相關(guān)關(guān)系

LPPCN陽性組腫瘤約25.6%（22/86）可形成VM，而不存在LPPCN的腫瘤VM陽性率僅3.4%（3/87）（表1），進(jìn)一步分析顯示LPPCN陽性組內(nèi)存在VM的腫瘤壞死面積較VM陰性者?。é?=4.414，P=0.042，圖1），而LPPCN陰性組無顯著差異（χ2=1.253，P=0.263）。

圖1　非小細(xì)胞肺癌VM陽性組和VM陰性組VM（黑色箭頭）和LPPCN比較（Bar=100微米）Figure 1Morphological characteristics of VM（black arrow）and LPPCN of the VM-positive group and VM-negative group（Bar=100 μm）

2.3NSCLC DKK1表達(dá)與VM、LPPCN及其相關(guān)蛋白之間的相關(guān)關(guān)系

本研究中173例NSCLC DKK1陽性率為68.21%（118/173），VM陽性組腫瘤DKK1陽性率88.0%，顯著高于VM陰性組，LPPCN陽性組約80.2%的腫瘤表達(dá)DKK1，LPPCN陰性組DKK1陽性率為56.3%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。Spearman相關(guān)分析表明NSCLC VM形成與LPPCN和DKK1呈正相關(guān)（r=0.281，0.175，P=0.000，0.022），DKK1高表達(dá)與β-catenin核表達(dá)、VE-Cadherin、Twist和Slug呈正相關(guān)（r=0.207、0.364、0.274、0.235，P= 0.006、0.000、0.000、0.002）。

2.4DKK1高表達(dá)促進(jìn)人NSCLC裸鼠移植瘤VM和LPPCN形成

本研究建立了H460-DKK1裸鼠移植瘤模型，觀察DKK1對(duì)H460細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)及VM和LPPCN形成影響。H460-DKK1組較對(duì)照組細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)，移植瘤生長(zhǎng)速度快，處死小鼠時(shí)H460-DKK1組腫瘤平均體積為（1.74±0.251）cm3，對(duì)照組腫瘤體積僅為（0.84±0.16）cm3（t=2.21，P＜0.05）。Endomuncin/PAS雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn)H460-DKK1組移植瘤VM數(shù)目較對(duì)照組多，形成VM的能力較強(qiáng)，內(nèi)皮依賴性血管數(shù)目較少（圖2）。同時(shí)對(duì)LPPCN計(jì)數(shù)顯示H460-DKK1組移植瘤LPPCN數(shù)目較對(duì)照組多，結(jié)果與VM形成趨勢(shì)一致。免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組腫瘤顯著高表達(dá)DKK1（圖3）。H460-DKK1組腫瘤中間葉性標(biāo)記物VE-Cadherin和Vimentin，EMT調(diào)控因子Twist和Slug表達(dá)顯著增高，而且Wnt通路的重要分子β-catenin核表達(dá)也顯著增多（圖3）。

表1　NSCLC中VM和LPPCN與臨床病理因素之間的關(guān)系Table 1The relationship between VM，LPPCN and clinicopathological parameters in non-small cell lung cancer

表1　NSCLC中VM和LPPCN與臨床病理因素之間的關(guān)系（續(xù)表1）Table 1The relationship between VM，LPPCN and clinicopathological parameters in non-small cell lung cancer

表2　不同DKK1水平的NSCLC VM、LPPCN及其相關(guān)蛋白之間的差異（續(xù)表2）Table 2The difference of VM，LPPCN and VM-associated proteins expression in the DKK1+and the DKK-groups in non-small cell lung cancer

圖2　DKK1高表達(dá)促進(jìn)人NSCLC裸鼠移植瘤VM和LPPCN形成P＜0.05Figure 2DKK1 overexpression promotes VM and LPPCN formation in non-small cell lung cancer H460 of the nude mice model P＜0.05

?圖3　H460-DKK1移植瘤與對(duì)照組移植瘤DKK1、MMP2、MMP9、VE-cadherin、Vimentin、β-catenin、Twist1和Slug蛋白表達(dá)差異（Bar=100微米）Figure 3The different expression of DKK1，MMP2，MMP9，VE-cadherin，Vimentin，β-catenin，Twist1，and Slug between the H460-DKK1 group and the control.（Bar=100 μm）

3 討論

LPPCN是孫保存教授發(fā)現(xiàn)并命名的黑色素瘤中特殊的腫瘤細(xì)胞死亡形式，本研究證實(shí)在NSCLC中也存在LPPCN現(xiàn)象，它們與內(nèi)皮依賴性血管或VM走行一致，人體標(biāo)本分析也顯示存在LPPCN的腫瘤VM陽性率更高，LPCCN與VM呈正相關(guān)，LPPCN陽性組腫瘤生物學(xué)行為與VM陽性組相近，說明存在LPPCN的腫瘤更容易形成VM，再次證實(shí)了本課題組的研究假設(shè)，線形排布LPPCN細(xì)胞被清除降解，局部形成管腔樣結(jié)構(gòu)，與血管連通后形成VM［11］。本研究還發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中LPPCN陽性率與VM陽性率相近［7］，而NSCLCLPPCN陽性率為49.71%，VM陽性率僅為14.45%，具有LPPCN的NSCLC約25.59%可形成VM，形成VM者腫瘤壞死面積較小，未形成VM的腫瘤壞死面積較大。上述結(jié)果提示VM不是LPPCN的唯一結(jié)局，LPPCN形成VM后，血液流入缺氧狀態(tài)緩解，腫瘤細(xì)胞存活；未形成VM者持續(xù)缺氧造成腫瘤組織大面積壞死。

腫瘤組織內(nèi)的高壓微環(huán)境和缺氧是VM形成的主要驅(qū)動(dòng)因素［12］，它們二者可能也是LPPCN的直接誘因［13-14］。為進(jìn)一步研究調(diào)控NSCLC VM和LPPCN形成的分子機(jī)制，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)VM陽性組腫瘤和LPPCN陽性組DKK1表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)，上調(diào)DKK1的NSCLC移植瘤VM和LPPCN形成能力也顯著提高，提示DKK1參與了NSCLC中VM和LPPCN形成過程。EMT和細(xì)胞外基質(zhì)重塑是VM形成過程中的重要環(huán)節(jié)，Twist1、Slug等多種EMT調(diào)控因子均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生塑型［15-17］，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9通過誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)VM形成。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC DKK1與Twist1、Slug及VM相關(guān)分子表達(dá)呈正相關(guān)。因此本研究推測(cè)DKK1一方面能夠促進(jìn)部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生LPPCN為VM形成提供空間，另一方面還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Twist1、Slug、MMP2等分子，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)重塑、癌細(xì)胞EMT等，共同參與調(diào)控VM形成。

DKK1是經(jīng)典Wnt通路的拮抗劑［18］，它與Wnt信號(hào)的共受體LRP5/6胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻止β-catenin解離入核，本研究報(bào)道DKK1在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，并可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT和VM形成［19］，而本研究發(fā)現(xiàn)DKK1可促進(jìn)NSCLC VM和LPPCN形成，其經(jīng)過也與EMT相關(guān)，提示DKK1可能在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)由不同的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮各異的作用。同時(shí)DKK1可抑制Wnt/β-catenin經(jīng)典通路［20］，DKK1還參與Wnt非經(jīng)典信號(hào)途徑，DKK1可阻滯Wnt3a介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞的NF-κB配體減少、可直接抑制NF-κB受體激活因子配體RANKL的表達(dá)、可調(diào)節(jié)β-catenin和RUNX2、可調(diào)控p-RB及AKT/NF-kB等［21-22］。DKK1也是β-catenin下游通路的靶點(diǎn)，如食管腺癌中β-catenin入核后與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TCF/LEF-1結(jié)合可上調(diào)DKK1表達(dá)［23］。本研究發(fā)現(xiàn)DKK1表達(dá)與β-catenin的核定位呈正相關(guān)，Chen等［24］報(bào)道DKK1可以促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌β-catenin轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)β-catenin下游基因MMP7的表達(dá)從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。本研究推測(cè)NSCLC中Wnt經(jīng)典通路被激活后β-catenin由胞漿入核，可促進(jìn)其靶基因DKK1高表達(dá)，DKK1還可反饋性促進(jìn)β-catenin活性。本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin下游基因cmyc上調(diào)可促進(jìn)黑色素瘤表達(dá)snail/bax促進(jìn)LPPCN和VM形成［25］。

本研究在NSCLC中觀察了VM是LPPCN的結(jié)局之一，LPPCN形成VM之后，血液流入缺氧狀態(tài)緩解，腫瘤細(xì)胞存活；未形成VM者導(dǎo)致持續(xù)缺氧，造成腫瘤細(xì)胞發(fā)生大面積壞死。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子DKK1促進(jìn)NSCLC LPPCN和VM形成的機(jī)制與DKK1表達(dá)上調(diào)引起的β-catenin、Twist1及VM調(diào)控分子表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)EMT和細(xì)胞外基質(zhì)重塑，進(jìn)而促進(jìn)VM形成，但分子之間的調(diào)控關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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（2016-07-10收稿）

（2016-08-27修回）

（編輯：楊紅欣校對(duì)：武斌）

姚伶俐專業(yè)方向?yàn)椴±韺W(xué)基礎(chǔ)研究。

E-mail：ahmuyao@126.com

DKK1 promotes linearly patterned programmed cell necrosis and vasculogenic mimicry in non-small cell lung cancer

Lingli YAO1，Danfang ZHANG1，2，Xiulan ZHAO1，2，Xueyi DONG1，F(xiàn)ang LIU1，Xian LIN1，Junying SUN1，Xu ZHENG1
1Correspondence to:Danfang ZHANG；E-mail:danfangzhang@hotmail.com

Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2Department of Pathology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

Objective:To investigate the effect of DKK1 on linearly patterned programmed cell necrosis（LPPCN）and vasculogenic mimicry（VM）and the related molecular mechanism in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods:A total of 173 human NSCLC specimens were collected to detect LPPCN by H&E staining，detect VM with CD31/PAS double staining，and investigate DKK1 and related protein expression by immunohistochemistry.The clinical pathological significance of LPPCN，VM，and DKK1 and the correlation of them were analyzed.Human NSCLC H460-DKK1 cells were engrafed in nude mice to evaluate the influence of DKK1 up-regulation on VM and LPPCN in vivo.Results:Approximately，14.45%（25/173）of NSCLC had VM and 49.71%（86/173）had LPPCN.25.6%（22/86）of NSCLC cases in LPPCN-positive group formed VM.Both of VM and LPPCN were all correlated with poor differentiation，late TNM stage，easy recurrence and metastasis and poor prognosis in NSCLC.DKK1 expression in the VM-positive group and the LPPCN-positive group was higher than that in the VM-negative group and the LPPCN-negative group，respectively.DKK1，LPPCN，and VM were positively correlated with VE-cadherin，MMP-2，β-catenin nuclear expression and Twist1.H460-DKK1 transplantation tumor model confirmed that DKK1 promotes the expression of VM and LPPCN and related proteins in NSCLC.Conclusion:The increase of the β-catenin and Twist1 expression induced by DKK1 may promote the formation of LPPCN and VM in NSCLC.

non-small cell lung cancer，vasculogenic mimicry，DKK1，epithelial mesenchymal transition，linearly patterned programmed cell necrosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.807

①天津醫(yī)科大學(xué)病理教研室（天津市300070）；②天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：81230050）和國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81572872）資助

張丹芳danfangzhang@hotmail.com