三角帆蚌短型肽聚糖識別蛋白S3基因克隆及表達分析

李海軍　張建強　吳圣楠　隗黎麗　劉　毅

（1. 江西師范大學生命科學學院，南昌 330022； 2. 江西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，南昌 330045）

三角帆蚌短型肽聚糖識別蛋白S3基因克隆及表達分析

李海軍1張建強1吳圣楠1隗黎麗2劉毅1

（1. 江西師范大學生命科學學院，南昌 330022； 2. 江西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，南昌 330045）

肽聚糖識別蛋白（PGRPs）是機體先天免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體，研究對三角帆蚌的一種短型肽聚糖識別蛋白進行了克隆與表達分析。研究采用5′、3′ RACE技術(shù)，對高通量轉(zhuǎn)錄組測序所得三角帆蚌PGRPS3基因（hcPGRPS3）片段分別進行了5′，3′末端克隆，經(jīng)拼接得到hcPGRPS3 cDNA全長序列。采用多種分子生物學軟件對hcPGRPS3 cDNA全長序列進行了特征分析，實時熒光定量（qRT-PCR）檢測了其組織分布，及經(jīng)肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后其在肝胰腺中的基因表達變化。hcPGRPS3 cDNA全長1438 bp，開放閱讀框為858 bp，編碼285個氨基酸，預測分子量大小為32.3 ku，pH 7.0時的理論等點為7.98。序列中不存在信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列保守性分析表明，其他物種短型PGRP中，以夏威夷短尾魷PGRP4與hcPGRPS3同源性最高（51%）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，hcPGRPS3在性腺及肝胰腺中表達水平較高。經(jīng)PGN或LPS刺激后，肝胰腺中hcPGRPS3表達水平顯著上調(diào)，表明hcPGRPS3可能在機體抗菌免疫反應中發(fā)揮重要作用。

肽聚糖識別蛋白；三角帆蚌；基因克??；基因表達

肽聚糖識別蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）是一類在先天免疫中發(fā)揮重要作用的模式識別受體（PRRs），因其對細菌細胞壁成分肽聚糖（PGN）的識別作用而命名為肽聚糖識別蛋白，從昆蟲到哺乳動物其結(jié)構(gòu)高度保守［1，2］。研究者最早于1996年在家蠶（Bombyx mori）發(fā)現(xiàn)PGRP，發(fā)現(xiàn)其能結(jié)合革蘭氏陽性菌PGN，并激活酶原級聯(lián)反應［3］。除了識別病原體，某些PGRPs還表現(xiàn)出顯著的酰胺酶活性［4］，及強力殺菌活性［5］。研究還發(fā)現(xiàn)，PGRPs不僅能結(jié)合PGN，部分PGRPs還能結(jié)合LPS，以及肽聚糖結(jié)合槽結(jié)合位點以外的其他病原體配體［6］。PGRPs在觸發(fā)免疫信號轉(zhuǎn)導通路進而激活抗菌肽、細胞的吞噬作用和PGN水解中發(fā)揮重要功能，在先天免疫中具有不可或缺的作用［7—9］。

PGRPs可分為短型（無脊椎動物PGRP-S與脊椎動物PGLYRP-1）、長型（無脊椎動物PGRP-L與脊椎動物PGLYRP-2）和中間型（無脊椎動物PGLYRP-3、PGLYRP-4），在大多數(shù)種類動物中都有發(fā)現(xiàn)，包括昆蟲、軟體動物、棘皮動物、魚類、兩棲動物、鳥類及哺乳動物［10］。對軟體動物PGRPs的研究較晚，近年來陸續(xù)有研究報道，包括夏威夷短尾魷（Euprymna scolopes）［11］、海灣扇貝（Argopecten irradians）PGRP［12］、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）［13］、盤鮑（Haliotis discus discus）［14］、長牡蠣（Crassostrea gigas）［15］、大竹蟶（Solen grandis）［16］，在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）中也有關(guān)于PGRPS1基因的研究報道［17］。

三角帆蚌分布廣泛，主要分布在鄱陽湖、洞庭湖、太湖、巢湖和洪澤湖五大湖，是目前應用最廣的良種淡水育珠蚌，而細菌感染引起的疾病日益嚴重［18］。本研究克隆了hcPGRPS3 cDNA序列全長，對其基因序列特征進行了分析，并研究了其在PGN及LPS后刺激后的表達變化情況，為三角帆蚌細菌性疾病的免疫防治提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所選用的三角帆蚌購自南昌市人民公園菜市場。研究選用的三角帆蚌體長約10—15 cm。購回實驗室后，立即用自來水將蚌殼上的淤泥仔細刷洗干凈，置于盛有曝氣自來水的水族箱（100 cm× 60 cm×45 cm）中暫養(yǎng)，箱中水量不宜過多，以剛剛淹沒蚌體為佳。每天用曝氣自來水換水1—2次，充氣泵充氣飼養(yǎng)，暫養(yǎng)1周確認蚌體健康無病之后方開始實驗。三角帆蚌的具體飼養(yǎng)條件同文獻［19］。

本研究所用外源刺激物PGN和LPS購自Sigma-Aldrich公司，PGN源自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），LPS源自大腸桿菌（Escherichia coli，0111：B4），使用前分別溶解于PBS緩沖液中使最終濃度為1 mg/mL。

1.2核酸提取與cDNA模板合成

采用TaKaRa公司的RNAiso Plus提取組織總RNA，操作過程中（包括組織總RNA提取以及應用RNA的所有相關(guān)實驗）琉璃器皿及金屬器械經(jīng)180℃高溫烘烤6h以上使RNase徹底失活，使用Thermo公司QSP RNase & DNase Free離心管和槍頭。RNA的具體提取參考提取試劑說明書進行。cDNA合成按Takara PrimeScriptTMReverse Transcriptase Kit操作手冊進行。

1.3hcPGRPS3 cDNA全長獲得

hcPGRPS3 cDNA 5′端片段克隆始自hcPGRPS3 cDNA的1條長段序列（1426 bp）由轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果獲得。依據(jù)此序列，采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒獲得該基因的5′端序列。擴增時共設(shè)計3條基因特異引物：GSP1、GSP2及GSP3。首先提取總RNA； 使用SUPERSCRIPT II RT 酶和引物GSP1 對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成，使用RNase Mix對合成的cDNA進行去RNA處理； 使用DNA 純化試劑盒對經(jīng)RNAase處理過的cDNA進行純化； 使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA進行末端加上多聚C； 使用引物GSP2和試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP對已經(jīng)加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增； 使用引物GSP3和試劑盒里面帶的橋連通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增； 將第二輪PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化； 純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進行連接，轉(zhuǎn)化后對陽性克隆進行測序。

hcPGRPS3 cDNA 3′端片段克隆采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3′端序列。擴增時共設(shè)計2條引物：PGRPS3-F1與PGRPS3-F2。首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS primer A 對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA； 使用引物PGRPS3-F1和通用引物UPM（Long引物和Short引物按1∶3比例混勻所得），以上面合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增； 將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物PGRPS3-F2和 UPM進行第二輪PCR擴增，將第二輪PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化； 純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進行連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測序。將5′RACE、3′RACE序列及高通量測序片段拼接，從而得到hcPGRPS3基因全長cDNA序列。用于hcPGRPS3基因擴增與表達的引物見表1。

表1　hcPGRPS3基因擴增和表達所用引物Tab. 1　Primers used in the current study

1.4hcPGRPS3基因序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用NCBI ORF Finder在線軟件尋找開放閱讀框，并翻譯出氨基酸序列全長； ProtParam tool預測蛋白質(zhì)分子大小、理論等電點； NetNGlyc 1.0 Server分析潛在N-糖基化位點； Signalp 4.1 server預測信號肽； TMHMM在線預測跨膜螺旋； Pfam HMM分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域； 使用NCBI上BLASTp軟件進行同源性搜索和不同物種PGRPs氨基酸同一性比對；ClustalW 1.83軟件進行氨基酸序列比對，Mega 5.0軟件N-J法構(gòu)建進化樹。用于氨基酸比對和進化樹構(gòu)建的基因名稱及其GenBank序列登錄號見表2。

1.5hcPGRPS3在不同組織中的表達

本實驗的總RNA提取每個樣本挑選3只健康未經(jīng)任何處理的三角帆蚌作為3個平行樣，分別取鰓、性腺、心臟、肝胰腺和外套膜組織，用Trizol法提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)hcPGRPS3基因cDNA全長序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計hcPGRPS3基因qRT-PCR特異性引物（表1），根據(jù)三角帆蚌β-actin基因全長cDNA序列設(shè)計內(nèi)參照基因引物（表1）。反應條件如下：（1） 95℃ 3min；95℃ 10s，55℃ 20s，72℃ 20s，40個循環(huán)； 72℃ 5s；（2） 從65℃開始，每5s升溫0.5℃至95℃繪制溶解曲線。每1個平行樣hcPGRPS3基因和β-actin基因做3次重復熒光定量，3次重復平均值為最終熒光定量值。

表2　用于氨基酸序列比對和構(gòu)建進化樹的基因登錄號Tab. 2　GenBank accession number used in the alignment and phylogenetic tree construction

使用BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)內(nèi)置軟件進行溶解曲線分析，將心臟組織PGRPS3基因mRNA的表達量設(shè)為1，采用2-ΔΔCt法計算hcPGRPS3基因的相對表達值，使用SPSS 18.0計算標準誤差。

1.6注射PGN或LPS后hcPGRPS3在肝胰腺中的表達變化

取三角帆蚌3只于閉合肌注射PBS緩沖液100 μL，作為對照組（0），注射后取肝胰腺組織。取三角帆蚌60只用作刺激實驗，隨機分為2組。分別于閉合肌注射100 μL PGN或 LPS進行免疫，并于注射后3h、6h、12h、24h和36h取蚌的肝胰腺組織（n=3）。Trizol法提取各組織的總RNA，利用qRT-PCR法檢測經(jīng)PGN和LPS刺激后hcPGRPS3在肝胰腺組織中的表達變化（擴增條件同1.5）。將對照組0 h肝胰腺組織hcPGRPS3基因mRNA表達量設(shè)為1，采用2-ΔΔCt法計算不同刺激組肝胰腺中hcPGRPS3基因的相對表達值，結(jié)果使用SPSS18.0單因素方差分析法（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析（n=3），P＜0.05為顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1hcPGRPS3基因cDNA序列全長及推導的氨基酸

5′ RACE擴增獲得472 bp片段，3′ RACE擴增獲得664 bp片段，序列拼接獲得的hcPGRPS3基因cDNA序列全長1438 bp（GenBank登錄號：KJ123767），其中5′端非翻譯區(qū)72 bp和3′非翻譯區(qū)508 bp，3′非翻譯區(qū)，有2個mRNA不穩(wěn)定信號（ATTTA）和多聚腺苷酸加尾信號（ATTAAA）。該基因開放閱讀框為858 bp，編碼285個氨基酸，預測蛋白分子量大小為32.3 ku，pH7.0時理論等電點為7.98，含2個潛在N-糖基化位點（N40PT和N92YS），有PGRP結(jié)構(gòu)域（aa126—263）。多重比對結(jié)果證明hcPGRPS3符合PGRPs所有特征。hcPGRPS3無信號肽與跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2PGRPs同源性比較與系統(tǒng)進化關(guān)系

利用NCBI在線Blast對軟體動物多個物種的多種PGRPs氨基酸序列進行了同源性比對，各物種間PGRPs的相似性見表2。由表可知，其他物種短型PGRP中，以夏威夷短尾魷PGRP4與hcPGRPS3同源性最高（51%）。選取其他軟體動物類PGRPs蛋白序列應用Mega 5.0軟件按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化樹表明：hcPGRPS3與夏威夷短尾魷PGRP4（短型）及盤鮑短型PGRP最先聚為一枝，又與夏威夷短尾魷其他短型PGRP聚為一枝，表明在所選物種中，它們之間的進化關(guān)系最為密切（圖1）。

圖1　hcPGRPS3的N-J系統(tǒng)進化樹Fig. 1　Neighbor-joining phylogenetic tree analysis of hcPGRPS3使用Clustral X 1.83 軟件進行序列比對，MEGA 5.0按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)點處數(shù)值代表1000評估的自舉檢驗置信度。PGRP氨基酸序列登錄號詳見表2Full-length amino acid sequences were aligned using Clustral X 1.83 and a phylogenetic tree was constructed using Neighbor-Joining algorithm with MEGA 5.0（1000 bootstrap）. The GenBank accession numbers of PGRP are shown in Tab. 2

2.3hcPGRPS3組織表達

hcPGRPS3組織表達分布如圖2所示。hcPGRPS3在所檢測組織中均有表達，在性腺中的表達水平最高，其次為肝胰腺，而在鰓、心臟和外套膜表達量最低。

圖2　不同組織中hcPGRPS3相對表達量Fig. 2　Expression of hcPGRPS3 in different tissues

2.4PGN或LPS刺激后肝胰腺中hcPGRPS3表達變化

經(jīng)PGN刺激3—12h肝胰腺中hcPGRPS3表達水平顯著性上調(diào)（P＜0.05），3h時表達水平為最高，在24h后表達水平逐漸恢復為0h正常值（圖3）； 而經(jīng)LPS刺激6—24h肝胰腺中hcPGRPS3表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），以6h表達水平為最高，且在36h后hcPGRPS3的表達水平逐漸恢復為0時正常值（圖3）。

圖3　PGN或LPS刺激后hcPGRPS3相對表達量Fig. 3　The role of PGN and LPS on the expression of hcPGRPS3

3　討論

在進化過程中，先天免疫系統(tǒng)通過一系列高度保守的模式識別受體（PRRs）識別微生物［1］。肽聚糖識別蛋白（PGRPs）屬于先天免疫PRRs家族，從昆蟲到哺乳動物高度保守［2］，所有的PGRPs都有一個長約160個氨基酸的PGRP結(jié)構(gòu)域。短型PGRPs蛋白約為200個氨基酸長，分子量大小約為18—20 ku，大多數(shù)長型和中間型大小的PGRPs（無脊椎動物PGRP-L和脊椎動物PGLYRP-2）蛋白至少有400個氨基酸長［10］。大竹蟶（S. grandis） PGRP-S1、PGRP-S2分別編碼270和141個氨基酸［16］。許氏平鲉（Sebastes schlegeli）PGRP-L1、PGRP-L2分別編碼466和482個氨基酸［20］。本研究中所克隆的hcPGRPS3開放閱讀框編碼285個氨基酸，預測蛋白質(zhì)分子量為32.3ku，等點為7.98，有PGRP結(jié)構(gòu)域（aa126—263）長度為138個氨基酸。氨基酸序列同源比對顯示hcPGRPS3與夏威夷短尾魷PGRP4（短型）相似性最高，達51%，系統(tǒng)進化樹表明hcPGRPS3與夏威夷短尾魷和盤鮑短型PGRP聚為一枝。以上結(jié)果表明：本研究克隆的hcPGRPS3確為PGRPs家族成員，是一種短型PGRP。

PGRPs主要功能是識別和結(jié)合PGN及激活下游免疫應答，當與細菌PGN結(jié)合后，PGRPs可以抑制或激活下游免疫信號通路如Toll和IMD途徑［21，22］或JNK信號通路［23］。但一些PGRPs也表現(xiàn)出顯著酰胺酶活性和強力殺菌活性［4，5］。PGRPs分子正面是肽聚糖結(jié)合槽，背面為PGRP特異性區(qū)域［24］。酰胺酶可以通過水解細菌PGN的酰胺鍵起到殺菌功能，所有具有酰胺酶活性的PGRPs（無脊椎動物和脊椎動物）PGN結(jié)合位點，由兩個組氨酸（His）、一個酪氨酸（Tyr）及一個半胱氨酸（Cys）組成。在無酰胺酶活性的PGRPs PGN結(jié)合位點中，半胱氨酸（Cys）被絲氨酸（Ser）取代，可以由此來推測PGRPs有無酰胺酶活性［25］。與其他物種PGRPs的序列比對發(fā)現(xiàn)，hcPGRPS3肽聚糖結(jié)合槽處高度保守的四個氨基酸殘基為His141、Tyr176、His250和Ser259，hcPGRPS3酰胺酶活性位點中的半胱氨酸（Cys）被絲氨酸（Ser）取代而不具有酰胺酶活性，可能不具有水解細菌PGN的酰胺鍵功能。類似的，夏威夷短尾魷PGRP4（esPGRP4）的酰胺酶活性位點C160也被絲氨酸（Ser）取代而不具有酰胺酶活性，esPGRP4功能可能僅限于：識別PGN，或者誘導觸發(fā)Toll/NF-κB磷酸化催化級聯(lián)反應的信號轉(zhuǎn)導功能［11］。這種功能也與果蠅（Drosophila melanogaster） PGRP-SA類似［26］，hcPGRPS3可能也具有類似功能。通過預測發(fā)現(xiàn)hcPGRPS3不存在信號肽和跨膜螺旋，可能為胞內(nèi)蛋白。esPGRP1也無信號肽和跨膜螺旋，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析認為是一種胞內(nèi)定位蛋白［11］。hcPGRPS3是一種非典型的軟體動物PGRP，蛋白無酰胺酶活性，很可能為胞內(nèi)蛋白。

PGRPs在動物組織中表達廣泛，而不同生物體PGRPs在不同組織中的表達水平各異。美國紅魚（Sciaenops ocellatus） PGRP在腦、腎、肌肉、鰓、血液、脾臟、心臟及肝臟均有表達，以肝臟的表達量為最高［27］。海灣扇貝（A. irradians）PGRP在性腺、鰓、血細胞、腎、外套膜及閉合中均有表達，以血細胞中的表達量最高［12］。三角帆蚌PGRPS1基因在肝胰腺中表達水平最高，其次為性腺［17］。而本研究則發(fā)現(xiàn)hcPGRPS3在三角帆蚌的鰓、性腺、心臟、肝胰腺和外套膜組織均有表達，而以性腺的表達水平最高，其次為肝胰腺。hcPGRPS3在不同組織中的表達模式表明：性腺和肝胰腺可能是主要的效應器官。

在一些細菌或病原相關(guān)分子模式（PAMPs）刺激下PGRP表達水平會發(fā)生上調(diào)或者下降，或者無顯著變化。在細菌刺激下櫛孔扇貝（C. farreri） 血細胞中肽聚糖識別蛋白S1（cfPGRP-S1）的表達水平顯著上升，鰻弧菌（革蘭氏陰性菌）刺激下24h后cfPGRP-S1表達量上升到顯著水平（持續(xù)到48h），溶壁微球菌（革蘭氏陽性菌）刺激下12h后cfPGRP-S1表達量上升到顯著水平（持續(xù)到48h）［13］。盤鮑（H. discus discus）鰓中肽聚糖識別蛋白（hdPGRP）在PGN（源自金黃色葡萄球菌）刺激下，早期階段（3—6h）表達水平下調(diào)，后期階段（24—48h） hdPGRP表達水平顯著上調(diào)； 在LPS（源自大腸桿菌）刺激下，早期階段（6—12h） hdPGRP表達水平上調(diào)，后期階段（24—48h）恢復為正常水平，但在3h暫時出現(xiàn)表達水平下調(diào)現(xiàn)象［14］； PGN（3—6h）和LPS（3h）刺激下hdPGRP表達水平的下降，可能是由于鰓組織免疫細胞與外部環(huán)境微生物頻繁接觸產(chǎn)生了耐受性內(nèi)毒素造成的［14］。三角帆蚌肝胰腺中PGRPS1 基因在LPS或PGN刺激后表達水平無顯著性變化［17］。而本研究結(jié)果表明，三角帆蚌在經(jīng)PGN刺激后3—12h，肝胰腺中hcPGRPS3表達水平顯著性上調(diào)，在3h達到最大值，后期恢復（24h后）為正常水平； 經(jīng)LPS刺激后6—24h，肝胰腺中hcPGRPS3表達水平顯著上調(diào)，在6h達到最大值，而36h后表達恢復為正常水平。經(jīng)PGN和LPS誘導后hcPGRPS3表達上調(diào)，這與aiPGRP、sgPGRPS1、sgPGRP-S2的誘導結(jié)果類似； PGN及LPS對hcPGRPS3的誘導結(jié)果非常相似，表明hcPGRPS3在對細菌PGN和LPS的識別或結(jié)合上具有重要的作用。本研究結(jié)果將為開展更準確的hcPGRPS3基因研究提供一定的參考理論基礎(chǔ)。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF SHORT TYPE PEPTIDOGLYCAN RECOGNITION PROTEIN S3 GENE FROM HYRIOPSIS CUMINGII

LI Hai-Jun1，ZHANG Jian-Qiang1，WU Sheng-Nan1，WEI Li-Li2and LIU Yi1
（1. College of Life Sciences，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China； 2. College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

The present study cloned and sequenced Hyriopsis cumingii PGRPS3（hcPGRPS3） and measured its expreesion in multiple tissues. Results showed that the hcPGRPS3 cDNA sequence was 1438 bp in length，consisting of a 858 bp open reading frame（ORF） encoding 285 amino acid residues with 32.3 ku of predicted molecular weight and 7.98 of the theoretical isoelectric point，which have no signal petptide and transmembrane helices but have two latent N-glycosylation sites N40PT and N92YS. Multiple alignment analysis revealed that hcPGRPS3 shareed the highest identity with Euprymna scolopes PGRP4（51%）. hcPGRPS3 expressed in all examined organs of healthy H. cumingii with the low level in gill，heart and mantle and high level in gonad and hepatopancreas. Lipopolysaccharide and Peptidoglycan obviously up-regulated the expression of hcPGRPS3 in hepatopancreas，suggesting that hcPGRPS3 may play an important role in H. cumingii hepatopancreas innate immunity system against bacterial challenged.

Peptidoglycan recognition proteins S3； Hyriopsis cumingii； Clone； Expression

Q344+.1

A

1000-3207（2016）05-0921-07

10.7541/2016.119

2015-08-25；

2015-12-25

國家自然科學基金項目（31060359）； 江西省自然科學基金（20122BAB204017）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31060359）； the Natural Science Foundation of Jiangxi Province（20122BAB204017）］

李海軍（1988—），男，河南信陽人； 碩士研究生； 主要研究方向為水產(chǎn)動物分子免疫。E-mail：haijunlisc@gmail.com

劉毅，男，博士； E-mail：yiliusan@jxnu.edu.cn