基于HepG2細(xì)胞模型的香菇柄粉多酚抗氧化及抗增殖活性

李 謠，陳金龍，夏春燕，盧可可，吳素蕊，明 建,3,*（.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 40075；.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 6503；3.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 4 0075）

基于HepG2細(xì)胞模型的香菇柄粉多酚抗氧化及抗增殖活性

李 謠1，陳金龍1，夏春燕1，盧可可1，吳素蕊2，明 建1,3,*
（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 4 00715）

以人肝癌細(xì)胞HepG2為細(xì)胞模型，經(jīng)過不同粉碎條件處理香菇柄粉后，研究香菇柄粉游離酚的細(xì)胞抗氧化及多酚抗增殖活性。結(jié)果表明：香菇柄粉游離酚的細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）值為9.90～24.22 μmol QE/100 g，普通粉碎組最高，納米超微粉碎組最低，CAA值隨粉體粒徑減小而降低（不經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗）；氣流超微粉碎組CAA值為0.65 μmol QE/100 g，普通粉碎組和納米超微粉碎組未表現(xiàn)出細(xì)胞抗氧化活性（PBS清洗）。香菇柄粉游離酚的抗增殖活性（半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）值）為1.888～5.213 mg/mL，結(jié)合酚的抗增殖活性（EC50值）為2.225～4.751 mg/mL，氣流超微粉碎處理對(duì)香菇柄粉結(jié)合酚的抗增殖活性有增強(qiáng)作用。

香菇柄粉；多酚；細(xì)胞抗氧化活性；抗增殖活性

香菇（Lentinus edodes（Berk.）sing）又名香蕈、香信、香菌、冬菇，是僅次于雙胞蘑菇的世界第二大食用菌[1]。作為一種藥食兩用真菌，香菇不僅營養(yǎng)豐富，還具有降血脂、降血壓、抗菌、延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生理活性[2-4]。香菇的食用部分由菌傘和菌柄兩部分組成，分別占干質(zhì)量的75%和25%，兩者的化學(xué)成分有很大的不同，劉存芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)每100 g干香菇菌柄中含糖類物質(zhì)73 g、蛋白質(zhì)6.8 g、脂溶性成分2.68 g、灰分6.1 g，還含有大量的維生素、礦物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，但是菌柄因不溶性粗纖維含量較高（約38 g/100 g），難以咀嚼，多被丟棄，不僅造成了極大的浪費(fèi)還產(chǎn)生了許多環(huán)境問題[6]。目前，微粉化已被證明是一種改善富含纖維植物食品質(zhì)地的有效方法，所以將香菇柄進(jìn)行粉碎處理是對(duì)其開發(fā)利用的有效途徑之一[7-9]。

對(duì)于香菇多酚抗氧化活性的研究，目前主要是通過化學(xué)分析法進(jìn)行測(cè)定，主要方法有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除法、羥自由基清除法、鐵還原力法、β-胡蘿卜素亞油酸法以及氧化自由基吸收能力法（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）等，如Cheung等[10]研究發(fā)現(xiàn)香菇多酚比草菇具有更強(qiáng)的自由基清除活性，在β-胡蘿卜素和亞油酸體系的抗氧化活性達(dá)到75.9%（20 mg/mL），DPPH自由基清除率為55.4%（6 mg/mL），自由基介導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化性溶血抑制率為94.9%（5 mg/mL）。但是化學(xué)抗氧化分析方法是在體外進(jìn)行的，不能反映機(jī)體對(duì)抗氧化劑的攝入情況以及機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境對(duì)抗氧化劑作用效果的影響。美國康奈爾大學(xué)劉瑞海教授于2007年建立了細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）評(píng)價(jià)方法[11-13]。此方法以人體肝癌細(xì)胞HepG2為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的生物利用、分布、吸收和代謝等情況，比傳統(tǒng)的化學(xué)分析法更具有生物相關(guān)性，且實(shí)驗(yàn)周期短、測(cè)定程序簡(jiǎn)單，是一種測(cè)定抗氧化活性更合理的方法。

本實(shí)驗(yàn)將香菇柄干燥后分別進(jìn)行普通粉碎、氣流超微粉碎、納米超微粉碎處理，以人肝癌細(xì)胞HepG2為細(xì)胞模型，研究不同粉碎處理后香菇柄粉多酚物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性，為合理利用香菇柄、開發(fā)香菇柄功能產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇“808”購于重慶北碚農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

丙酮、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、沒食子酸、福林-酚試劑、碳酸鈉均為分析純 成都科龍化工試劑廠；二甲苯、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）均為分析純 美國Fisher公司；2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，ABAP）為分析純 美國Wako化學(xué)試劑公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）均為分析純，青霉素、鏈霉素、慶大霉素均為生化試劑 美國Sigma公司；Hank平衡鹽溶液（Hank balanced salt solution，HBSS）、WME培養(yǎng)基（William’s medium E）、表皮生長(zhǎng)因子、肝素、胰島素以及其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑均為生化試劑 美國Gibco生物科技公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Atlanta生物科技公司；HepG2人體肝癌細(xì)胞 美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C012型高速粉碎機(jī) 九陽股份有限公司；YSC-701型超微粉碎機(jī) 北京燕山正德機(jī)械有限公司；LNJ-120型氣流粉碎機(jī) 綿陽流能粉體設(shè)備有限公司；CJM-SY-B型高能納米沖擊磨 秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司；BHC-II A2系列生物安全柜 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；5180R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；DM IRB型倒置顯微鏡 德國Leica儀器有限公司；HERA cell 240型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔黑色底部透明微孔板、96孔白色底部透明微孔板 美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

香菇采摘后24 h內(nèi)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，挑選無病蟲害、大小均勻的個(gè)體，小心用水洗干凈后，將香菇柄沿香菇傘1 cm處切分。擺放在通風(fēng)處至表面干燥，低溫烘干（45～60 ℃）至水分含量低于10%。

1.3.2 不同粉碎方式處理

普通粉碎香菇柄粉（coarse milled stipe，CMS）：烘干的香菇柄經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后，過100 目篩，得到普通粉碎香菇柄粉；氣流超微粉碎香菇柄粉（jet milled stipe，JMS）：將普通粉碎的香菇柄粉用LNJ-120氣流粉碎機(jī)粉碎2 h，得到氣流超微粉碎香菇柄粉，經(jīng)Mastersizer 2000激光粒度測(cè)定儀測(cè)得香菇柄粉平均粒徑分別為7.00、7.05 μm；納米超微粉碎香菇柄粉（nanomicronized stipe，NMS）：將普通粉碎的香菇柄粉用CJM-SY-B高能納米沖擊磨（不銹鋼粉碎腔體，氧化鋯球粉碎磨介，5～35 ℃調(diào)頻）粉碎處理6 h，制得納米超微粉碎香菇柄粉，經(jīng)Mastersizer 2000激光粒度測(cè)定儀測(cè)得香菇柄粉平均粒徑分別為0.54 μm和0.46 μm，最后于干燥陰涼處密封保藏，備用。

1.3.3 香菇柄粉多酚制備[14-15]

準(zhǔn)確稱取香菇柄粉2.0 g，加入丙酮（80%，4 ℃冷藏）50 mL，漩渦振蕩5 min后用均質(zhì)機(jī)（12 000 r/min）均質(zhì)3 min，于高速離心機(jī)中2 500×g分離10 min，取上清液。濾渣重復(fù)以上操作，并合并2 次的提取液，抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用超純水定容至25 mL，－80 ℃條件下貯存?zhèn)溆?，此為香菇柄粉游離酚（free polyphenol）。向殘?jiān)屑尤?0 mL 2 mol/L NaOH溶液，在氮?dú)猸h(huán)境下消化90 min，用鹽酸調(diào)至pH 2.0，然后使用正己烷除脂并棄去油脂層，加入30 mL乙酸乙酯，振蕩10 min后，4 000×g離心10 min，取上清液。乙酸乙酯重復(fù)提取5 次，合并上清液，抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用超純水定容至25 mL，－80℃條件下貯存?zhèn)溆?，此為香菇柄粉結(jié)合酚（bound polyphenol）。多酚含量用福林-酚法進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

[17-18]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞在含5% FBS的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基（WME、2 mmol/L谷氨酸鹽、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，Hepes）、5 μg/mL胰島素、0.05 μg/mL氫化可的松、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL慶大霉素）中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定[12,18]

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種到96孔板中（只接種內(nèi)部孔，為防止邊緣效應(yīng)），每孔細(xì)胞數(shù)約為6×104個(gè)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次。加入新鮮培養(yǎng)基、香菇柄粉游離酚（終質(zhì)量濃度梯度為0、1、2、4、6、8、10 mg/mL）、DCFH-DA熒光探針溶液（終濃度為25 μmol/L）以及標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素（終濃度梯度為0、1、2、4、6、8、10 μmol/L）。

將上述96孔板，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h，移去殘余培養(yǎng)液，然后加入100 μL/孔PBS，清洗一次或不經(jīng)PBS清洗，加入100 μL/孔ABAP溶液（終濃度為600 μmol/L），然后，立即于發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，入射光波長(zhǎng)485 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，每5 min測(cè)定一次，測(cè)定1 h。對(duì)照組用DCFH-DA和ABAP處理，不加香菇柄粉游離酚；空白組用DCFH-DA處理，不加入ABAP和香菇柄粉游離酚。

減去空白和初始熒光值后，香菇柄粉游離酚質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)時(shí)間-熒光值曲線下的面積即為CAA值，計(jì)算公式如下。

式中：∫SA為加入不同質(zhì)量濃度香菇柄粉游離酚提取物后的時(shí)間-熒光值曲線下積分面積；∫CA為空白組的時(shí)間-熒光值曲線下積分面積。

香菇柄粉游離酚提取物的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（median effective concentration，EC50）根據(jù)lg（fa/fu）對(duì)lg（劑量）的中效原理來計(jì)算[19]，式中：fa為香菇柄粉游離酚作用效應(yīng)（CAA值）；fu為（1－CAA）值，EC50值以3 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果取計(jì)算平均值，再將EC50值轉(zhuǎn)化為CAA值。香菇柄粉游離酚的CAA值以每100 g香菇柄粉相當(dāng)于槲皮素的含量表示（μmol QE/100 g）。

1.3.6 細(xì)胞毒性測(cè)定[12,16-17]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接于96孔白板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為4×104個(gè)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次。其中，樣品孔中加入100 μL含香菇柄粉多酚的培養(yǎng)基（每個(gè)質(zhì)量濃度梯度做3 個(gè)平行孔）。控制孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后開始測(cè)板：移去96孔板內(nèi)殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次，加50 μL/孔亞甲基藍(lán)溶液（98% HBSS、0.67%戊二醛、0.6%亞甲基藍(lán)）染色，于37 ℃培養(yǎng)1 h，然后移去染色液，并用去離子水清洗該96孔板至清洗液無色，吸去板中多余水分并風(fēng)干2～3 min，加100 μL/孔洗脫液（49% PBS、50%乙醇、1%醋酸），然后漩渦振蕩20 min，使孔內(nèi)已染色的細(xì)胞形成均勻的細(xì)胞懸浮液。最后，于570 nm波長(zhǎng)處讀取各孔中染色細(xì)胞懸浮液的吸光度。減少的吸光度計(jì)算公式如下。

1.3.7 細(xì)胞抗增殖能力的測(cè)定[12,20-21]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接于96孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×104個(gè)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次。其中，樣品孔中加入100 μL含香菇柄粉多酚的培養(yǎng)基（每個(gè)質(zhì)量濃度梯度做3個(gè)平行孔），控制孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后開始測(cè)板，測(cè)板操作同上述細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SigmaPlot12.5統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用±s表示，并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行Turkey多重比較分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粉碎方式處理后的香菇柄粉中多酚含量

不同粉碎方式處理后香菇柄粉中多酚含量如圖1所示。總體來看，香菇柄粉總酚含量約為4 mg/g，主要以游離酚為主，約占總多酚含量的94%。與普通粉碎組相比，氣流超微粉碎處理組中總酚含量顯著上升（P＜0.05），而游離酚與結(jié)合酚變化差異不顯著；在納米超微粉碎處理組中，游離酚、結(jié)合酚、總酚含量均顯著下降（P＜0.05）。綜上所述，氣流超微粉碎處理組效果優(yōu)于納米超微粉碎組，原因可能是由于氣流超微粉碎機(jī)的壓縮氣體在噴嘴處膨脹時(shí)可降溫，粉碎過程不伴隨熱量的生成，該處理在較低溫度下既能完成。然而納米超微粉碎是機(jī)械的研磨過程，會(huì)導(dǎo)致局部升溫，對(duì)酚類物質(zhì)產(chǎn)生一定的破壞[22]。張小利等[16]通過高效液相色譜（high performance liquid hromatography，HPLC）對(duì)香菇柄多酚進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，香菇柄多酚主要為沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸和槲皮素，其中游離酚以沒食子酸和兒茶素為主，結(jié)合酚以沒食子酸、兒茶素和槲皮素為主。

圖1 不同粉碎方式處理的香菇柄粉中多酚含量Fig. 1 Polyphenol contents of Lentinus edodes stipe powders with different sizes

2.2 基于HepG2細(xì)胞模型的香菇柄粉游離酚細(xì)胞抗氧化活性

表1 不同粉碎處理的香菇柄粉游離酚CAA值Table 1 CAA values of free polyphenols inLentinus eodes stipe powders with different sizes μmol QE/100 g

HepG2細(xì)胞內(nèi)ABAP產(chǎn)生的過氧 化氫自由基氧化還原型DCFH生成熒光物氧化型二氯熒光素（2’,7’-dichlorofluorescein，DCF），槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品和香菇柄粉游離酚作為抗氧化劑抑制了反應(yīng)的進(jìn)行，反映在實(shí)驗(yàn)中即為熒光強(qiáng)度的減小。細(xì)胞抗氧化能力的測(cè)定采用了2 種處理方法：不經(jīng)PBS清洗，主要反映抗氧化劑在細(xì)胞膜表面的抗氧化活性；PBS清洗，主要反映抗氧化劑在細(xì)胞內(nèi)部的抗氧化活性。由圖2～4可知，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品抑制熒光物DCF生 成的能力明顯強(qiáng)于香菇柄游離酚提取液，在2 種處理方法中，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品并沒有明顯的變化（圖2～4中a、b），而對(duì)于香菇柄粉游離酚未經(jīng)PBS清洗處理組抑制DCF生成的能力明顯強(qiáng)于經(jīng)PBS清洗處理組（圖2～4中c、d）。

圖2 普通粉碎香菇柄粉中游離酚的細(xì)胞抗氧化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 2 Cellular antioxidant activity (CAA) kinetic curve of free polyphenols in coarse-milled Lentinus edodes stipe powder

圖3 氣流超微粉碎香菇柄粉游離酚的細(xì)胞抗氧化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 3 CAA kinetic curve of free polyphenols in jet-milled Lentinus edodes stipe powder

圖4 納米超微粉碎香菇柄粉游離酚的細(xì)胞抗氧化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 4 CAA kinetic curve of free polyphenols in nano-micronized Lentinus edodes stipe powder

不同粉碎處理后的香菇柄游離酚細(xì)胞抗氧化活性（CAA值）如表1所示。在未經(jīng)過PBS清洗處理組中，香菇柄粉游離酚CAA值順序?yàn)镃MS-F＞JMS-F＞NMS-F；在經(jīng)過PBS清洗處理組中，普通粉碎處理組和納米超微粉碎處理組未檢測(cè)出具有CAA活性，氣流超微粉碎組CAA值為0.65 μmol QE/100 g，可能是由于氣流超微粉碎處理能增加香菇柄粉游離酚的溶出率，同時(shí)改變多酚的物理結(jié)構(gòu)，使其分子大小及顆粒大小降低，同時(shí)增加顆粒表面積，使香菇柄粉游離酚能順利進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出CAA活性[23-24]。Rosa等[25]研究了小麥糠顆粒大小對(duì)其抗氧化能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小麥糠表面積從0.09 m2增加到0.26～0.30 m2時(shí)，其抗氧化能力從30 mmol TEAC/kg增加到45 mmol TEAC/kg。整體而言，氣流超微粉碎處理能在一定程度上增強(qiáng)香菇柄游離酚的CAA活性，在各個(gè)粉碎處理組中，不經(jīng)過PBS清洗處理的CAA活性顯著大于經(jīng)過PBS清洗處理的CAA活性。

2.3 基于HepG2細(xì)胞模型的香菇柄粉多酚抗增殖活性

圖5 普通粉碎香菇柄粉多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性和增殖抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of polyphenols extracts from coarse-milledLentinus edodes stipe powder on human HepG2 liver cancer cells

圖6 氣流超微粉碎香菇柄粉多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性和增殖抑制作用Fig. 6 Inhibitory effect of polyphenols extracts from jet-milled Lentinus edodes stipe powder on human HepG2 liver cancer cells

不同粉碎方式處理的香菇柄粉中多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖活性和細(xì)胞毒性如圖5～7所示。普通粉碎處理組中，游離酚（圖5a）在質(zhì)量濃度≥1.71 mg/mL時(shí)顯示細(xì)胞毒性，此時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率為45.02%；結(jié)合酚（圖5b）在質(zhì)量濃度≥4 mg/mL時(shí)顯示細(xì)胞毒性，此時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率為89.33%。氣流超微粉碎處理組中，游離酚（圖6a）在質(zhì)量濃度≥2.85 mg/mL時(shí)顯示細(xì)胞毒性，此時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率為55.14%；結(jié)合酚（圖6b）在質(zhì)量濃度≥1.71 mg/mL時(shí)顯示細(xì)胞毒性，此時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率為44.87%。納米超微粉碎處理組中，游離酚（圖7a）和結(jié)合酚（圖7b）分別在質(zhì)量濃度≥3.24 mg/mL、≥4.80 mg/mL時(shí)顯示細(xì)胞毒性，此時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率均低于20%，可能是由于香菇柄經(jīng)過納米超微粉碎處理后，其粒徑太?。ǎ? μm），一方面容易造成香菇柄粉粉體凝結(jié)而影響多酚的溶出，另一方面對(duì)多酚分子本身也造成一定的破壞，從而使其抗增殖活性降低[26]。由此可知，當(dāng)達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，香菇柄多酚均顯示出一定毒性，而在無細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，香菇柄粉游離酚和結(jié)合酚提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有抑制作用。

圖7 納米超微粉碎香菇柄粉多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性和增殖抑制作用Fig. 7 Inhibitory effect of polyphenols extracts from nano-micronizedLentinus edodes stipe powder on human HepG2 liver cancer cells

不同粉碎方式處理后的香菇柄粉中多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖EC50值和細(xì)胞毒性CC50值如表2所示。香菇柄粉中游離酚EC50值從1.888 mg/mL到5.213 mg/mL，結(jié)合酚EC50值從2.225 mg/mL到4.751 mg/mL。其中，在普通粉碎處理組和氣流超微粉碎處理組中，游離酚抗增殖活性高于結(jié)合酚，而在納米粉碎處理組中，結(jié)合酚抗增殖活性高于游離酚，抗增殖活性大小順序?yàn)镃MS-F＞JMS-B＞JMS-F＞CMS-B＞NMS-B＞NMS-F。因此，氣流超微粉碎能在一定程度上增強(qiáng)香菇柄結(jié)合酚的抗增殖活性，而納米超微粉碎對(duì)香菇柄多酚的抗增殖活性并沒有增強(qiáng)作用。

表2 香菇柄粉多 酚對(duì)于HepG2細(xì)胞的抗增殖能力（EC50）和細(xì)胞毒性（CC50Table 2 Antiproliferation (EC50) and cytotoxicity (CC50) of polyphenols from Lentinus edodes stipe powders with different sizes on human HepG2 liver cancer cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將香菇柄干燥后分別進(jìn)行普通粉碎、氣流超微粉碎、納米超微粉碎處理，再以人肝癌細(xì)胞HepG2為細(xì)胞模型，對(duì)不同粉碎處理后香菇柄粉中多酚物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，香菇柄總酚含量約為4 mg/g，主要以游離酚為主，約占總酚的94%。細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，未經(jīng)PBS清洗處理的香菇柄粉中游離酚CAA值為9.90～24.22 μmol QE/100 g，CAA活性順序?yàn)镃MS-F＞JMS-F＞NMS-F；在經(jīng)PBS清洗處理的普通粉碎處理組和納米超微粉碎處理組未檢測(cè)出CAA活性，氣流超微粉碎組CAA值為0.65 μmol QE/100 g。因此，未經(jīng)PBS清洗處理的香菇柄粉中多酚物質(zhì)的CAA活性顯著大于經(jīng)過PBS清洗處理的CAA活性。同時(shí)，在無細(xì)胞毒性濃度范圍內(nèi)，香菇柄粉游離酚和結(jié)合酚提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有抑制作用，游離酚EC50值為1.888～5.213 mg/mL，結(jié)合酚EC50值為2.225～4.751 mg/mL，抗增殖活性大小為CMS-F＞JMS-B＞JMS-F＞CMS-B＞NMS-B＞NMS-F。綜上所述，香菇柄粉多酚具有一定的細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性，氣流超微粉碎能在一定程度上增強(qiáng)香菇柄粉多酚的細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性，而納米超微粉碎對(duì)香菇柄粉多酚的抗氧化及抗增殖活性并沒有增強(qiáng)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] KLEIN M A. Encyclopedia of dietary supplements[M]. New York: Mercel Dekker, 2005: 653-654. DOI:10.1081/E-EDS-120024880.

[2] BISEN P S, BAGHEL R K, SANODIYA B S, et al. Lentinus edodes: a macrofungu s with pharmacological activities[J]. Current Medicinal Chemistry, 2010, 17(22): 2419-2430. DOI:10.2174/092986710791698495.

[3] XU X, YAN H, TANG J, et al. Polysaccharides in Lentinus edodes: isolation, structure, immunomodulating activity and future prospective[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2014, 54(4): 474-487. DOI:10.1080/10408398.2011.587616.

[4] CHUNG W S, WANG J H, BOSE S, et al. Hepatoprotective effect of Lentinus edodes mycelia fermented formulation against alcoholic liver injury in rats[J]. Journal of Food Biochemistry, 2015, 39(3): 251-262. DOI:10.1111/jfbc.12124.

[5] 劉存芳, 田光輝, 賴普輝. 香菇柄中營養(yǎng)成分的開發(fā)與利用綜述[J]. 科技信息, 2008(1): 14-14. DOI:10.3969/ j.issn.1001-9960.2008.01.009.

[6] JIANG T, WANG Q, XU S, et al. Structure and composition changes in the cell wall in relation to texture of shiitake mushrooms (Lentinula edodes) stored in modified atmosphere packaging[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(5): 742-749. DOI:10.1002/ jsfa.3876.

[7] 高虹, 史德芳, 何建軍, 等. 超微粉碎對(duì)香菇柄功能成分和特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(5): 40-43.

[8] WANG C C R, CIOU J Y, CHIANG P Y. Effect of micronization on functional properties of the water caltrop (Trapa taiwanensis Nakai) pericarp[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4): 970-974. DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.08.048.

[9] MING J, CHEN L, HONG H, et al. Effect of superfi ne grinding on the physico-chemical, morphological and thermogravi metric properties of Lentinus edodes mushroom powders[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 95(12): 2431-2437. DOI:10.1002/jsfa.6967.

[10] CHEUNG L M, CHEUNG P C K, OOI V E C. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J]. Food Chemistry, 2003, 81(2): 249-255. DOI:10.1016/S0308-8146(02)00419-3.

[11] 夏春燕, 郭曉暉, 李富華, 等. 細(xì)胞抗氧化活性方法在食物抗氧化活性評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(15): 297-302.

[12] WOLFE K L, LIU R H. Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods, and dietary supplements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(22): 8896-8907. DOI:10.1021/jf0715166.

[13] WOLFE K L, LIU R H. Structure-activity relationships of fl avonoids in the cellular antioxidant activity assay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(18): 8404-8411. DOI:10.1021/jf8013074.

[14] SUN J, CHU Y F, WU X Z, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of common fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(25): 7449-7454. DOI:10.1021/jf0207530.

[15] OKARTER N, LIU C S, SORRELLS M E, et al. Phytochemical content and antioxidant activity of six diverse varieties of whole wheat[J]. Food Chemistry, 2010, 119(1): 249-257. DOI:10.1016/ j.foodchem.2009.06.021.

[16] 張小利, 夏春燕, 王慧清, 等. 超微粉碎對(duì)香菇多酚組成及抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(11): 42-49. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201511009.

[17] FALLER A L K, FIALHO E, LIU R H. Cellular antioxidant activity of Feijoada whole meal coupled with an in vitro digestion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(19): 4826-4832. DOI:10.1021/jf300602w.

[18] WOLFE K L, KANG X, HE X, et al. Cellular antioxidant activity of common fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(18): 8418-8426. DOI:10.1021/jf801381y.

[19] CHOU T C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J]. Pharmacological Reviews, 2006, 58(3): 621-681. DOI:10.1124/pr.58.3.10.

[20] FELICE D L, SUN J, LIU R H. A modifi ed methylene blue assay for accurate cell counting[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(1): 109-118. DOI:10.1016/j.jff.2008.09.014.

[21] 王立峰, 陳靜宜, 謝慧慧, 等. 薏米多酚細(xì)胞抗氧化及HepG2細(xì)胞毒性和抗增殖作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(14): 2990-3002. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.015.

[22] 張潔, 于穎, 徐桂花. 超微粉碎技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究, 2010, 31(1): 51-54. DOI:10.3969/ j.issn.1673-0747.2010.01.014.

[23] HEMERY Y M, ANSON N M, HAVENAAR R, et al. Dryfractionation of wheat bran increases the bioaccessibility of phenolic acids in breads made from processed bran fractions[J]. Food Research International, 2010, 43(5): 1429-1438. DOI:10.1016/ j.foodres.2010.04.013.

[24] 姚秋萍, 馬亞麗, 李健, 等. 超微粉碎技術(shù)對(duì)油菜花粉中槲皮素和山奈素溶出率的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(6): 43-45. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.06.004.

[25] ROSA N N, BARRON C, GAIANI C, et al. Ultra-fine grinding increases the antioxidant capacity of wheat bran[J]. Journal of Cereal Science, 2013, 57(1): 84-90. DOI:10.1016/j.jcs.2012.10.002.

[26] 張晶, 王秀全, 王德清, 等. 超微粉碎對(duì)人參中皂苷測(cè)定量的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18): 96-98. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.18.017.

Antioxidant and Antiproliferative Activity of Polyphenols in Lentinus edodes Stipe Powder on HepG2 Cells

LI Yao1, CHEN Jinlong1, XIA Chunyan1, LU Keke1, WU Surui2, MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives, Kunming 650223, China; 3. National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The antioxidant activity of free phenols and anti-proliferation activity of polyphenols in Lentinus edodes stipe powder after different crushing treatments on human liver cancer HepG2 cells were investigated in this study. The results showed that the cellular antioxidant activity (CAA) decreased with the decrease in power size. Specifi cally, the CAA value of free phenols from Lentinus edodes stipe powder ranged from 9.90 to 24.22 μmol QE/100 g; the coarse-ground group indicated the highest CAA value, while and the nano-ground group exhibited the lowest CAA level. The CAA of free phenols in Lentinus edodes stipe powder without washing with phosphate buffer saline (PBS) became lower with decreasing particle size. With PBS washing, only the jet-milled group had antioxidant activity with a CAA value of 0.65 μmol QE/100 g. The antiproliferative activity assay showed that EC50values of free phenols from Lentinus edodes stipe powder were 1.888–5.213 mg/mL while those of bound phenols were 2.225–4.751 mg/mL. This study shows that jet milling can improve the antiproliferative activity of Lentinus edodes stipe powder.

Lentinus edodes stipe powder; polyphenols; cellular antioxidant activity; antiproliferative activity

10.7506/spkx1002-6630-201611033

R151.2

A

1002-6630（2016）11-0190-07

李謠, 陳金龍, 夏春燕, 等. 基于HepG2細(xì)胞模型的香菇柄粉多酚抗氧化及抗增殖活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 190-196. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611033. http://www.spkx.net.cn

LI Yao, CHEN Jinlong, XIA Chunyan, et al. Antioxidant and antiproliferative activity of polyphenols in Lentinus edodes stipe powder on HepG2 cells[J]. Food Science, 2016, 37(11): 190-196. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611033. http://www.spkx.net.cn

2015-12-15

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471576）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B01）

李謠（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：liyao427@163.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com